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Identification bactérienne par la coloration de GRAM

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La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mis au point le protocole en 1884.
Les bactéries présentent toutes une paroi constituée d’une substance, la muréine qui est un peptidoglycanne. Celle-ci est recouverte par une membrane externe chez les bactéries Gram-, tandis que les bactéries à Gram+ en sont dépourvues. Cette paroi de part son organisation permet de les classer soit dans les Gram+ ou les Gram-. Cette information est importante car elle est utilisée dans la taxonomie. Elle permet ainsi, avec la reconnaissance de la morphologique et le mode de groupement des bactéries de renseigner sur l’ordre dont fait partie les bactéries étudiées.

Cette coloration de Gram se réalise en 7 étapes:

1 On réalise un frottis sur une lame de microscope à partir d’une suspension bactérienne: on agite la suspension afin de l’homogénéiser et d’éviter d’avoir un culot au fond du tube. Avec l’aide d’une anse que l’on aura préalablement stérilisé (en la passant sous le bec benzène), on prélève un peu de la solution bactérienne en plongeant le fil de platine de la anse dans le tube à essai.

2 On dépose ensuite ce prélèvement au milieu de la lame en faisant des rotations jusqu’à séchage.

3 On procède à la fixation du frottis soit avec de l’éthanol à 90° (5 minutes) puis on enflamme la lame ou on passe directement 3 fois la lame dans la flamme du bec Bunsen.

4 La coloration au violet de Gentiane (colorant basique): la lame est plongée pendant 2 à 3 minutes (en fonction de la concentration) dans la coloration au violet de gentiane. Toutes les bactéries sont colorées en violet puis rincer à l’eau déminéralisée.

5 Mordançage au lugol (solution iodo-iodurée) : étaler le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l’eau déminéralisée. Cette étape permet de stabiliser la coloration violette.

 

6 Décoloration à l’alcool: verser goutte à goutte l’alcool sur la lame inclinée obliquement. Surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d’eau déminéralisée. L’alcool pénettre dans la bactérie. La coloration au violet de Gentiane disparait. Les bactéries décolorées sont des bactéries Gram-. Si l’alcool ne traverse pas la paroi, on est en présence de bactéries Gram+.

 

7 Contre coloration avec de la Fuchsine ou de la Safranine: laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l’eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.  Les bactéries Gram- sont colorées en rose.

Exemples:

Les bactéries à Gram+:
Les Staphylocoques apparaissent en « grappe de raisin » violette.
les Streptocoques sous la forme d’une chainette violette.

Les bactéries à Gram-:
Echérichia coli (enterobactérie) apparait sous la forme de bacille rose.

Pourquoi les bactéries à Gram- ne restent-elles pas colorées en violet après la décoloration à l’alcool comme les bactéries à gram+?

La paroi des bactéries Gram+ est composée d’une 40ène de couche de peptidoglycanne ne permettant pas à l’alcool de traverser cette paroi épaisse tandis que la paroi des bactéries à Gram- n’est formée que d’une seule couche de peptidoglycanne.

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