Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide

Méthode dite du nombre le plus probable

Principe général : Les prises d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont incorporées dans un milieu de culture liquide conçu pour permettre la croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. La croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible (virage d’un indicateur de pH coloré).

Principe de la méthode du nombre le plus probable : cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organismes supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire. L’estimation de la densité  bactérienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs dilutions successives de la suspension bactérienne originelle dans des milieux de cultures liquides. Il s’agit d’une méthode quantique et non pas énumératif.

Protocole expérimental d’une dilution successive de facteur 10 :

Matériel :

•  5 tubes contenant 9 mL de diluant (eau distillée en général sauf indication contraire: eau physiologique, eau peptonée, tryptone-sel, …).
• 5 pipettes stériles en plastique de 1mL
• 1 vortex (facultatif)

Réalisation de la dilution  de facteur 10 :

• Homogéneiser la suspension microbienne à prélever (agitation par mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à l’aide d’un vortex).
• Ouvrir et flamber l’ouverture du tube.
• Prélever 1mL de suspension à l’aide de la pipette plastique stérile (ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1cm).
• Flamber et refermer le tube.
• Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, flamber l’ouverture y introduire le volume prélevé (éviter tout contact entre la pipette contenant l’inoculum et le diluant stérile).
• Flamber et refermer le tube.
• Jeter la pipette souiller dans le bac à eau de javel.

La dilution suivante s’effectue comme la dilution décrite ci-dessus mais en partant du tube de la dilution précédente.

Exemple :

La dilution 10-5 sera effectué en prenant 1mL de la dilution 10-4 préalablement  homogenéïsée qui sera introduit dans un tube contenant 9 mL de diluant. L’utilisation de cette méthode avec un tube par dilution entraîne une forte incertitude que des methodes statistiques tentent de pallier par des essais multiples (2 ou 3 tubes par dilution).

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Observation des résultats : La seule manière de savoir si un micro-organisme est présent ou non dans l’inoculum par les techniques en milieu liquide sera de le mettre en évidence par un de ses caractères:  trouble et production de en gaz en BLBVB (bouillon lactose bilie au vert brillant). Si l’un de ses caractères apparait, le résultat sera positif. L’absence de l’un de ses caractères, le résultat sera négatif.

Exemple de resultat :

Il y a au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-3  et moins d’un micro-organisme dans 1mL  de la dilution 10-4 et donc on peut en déduire qu’il y a au moins 103 micro-organismes mais moins de 104 micro-organismes dans 1mL de produit pur.

Résultat avec des essais multiples (3 tubes par dilution):

Interprétation statistique: méthode du NPP (table de Mac Grady) :

Dans la ligne « chiffre égal à la somme des tubes positifs », choisir le nombre à 3 chiffres le plus grand possible et inférieur à 330 (meilleur répartition dans les dilutions). Se reporter au table de Mac Grady pour 3 tubes de dilution afin de trouver le NPP correspondant au nombre 321: le NPP est 15.

Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10–2  mL. D’après les limites de confiance données par certaines tables, cette valeur numérique de 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38 avec une probabilité de 95 %, entre 2 et 52 avec une probabilité de 99 %.

En déduire la concentration en micro-organismes par mL de produit pur N.

NPP= nombre le plus probable obtenu par lecture de la table de Mac Grady

V inoculum= 1 mL

Fd= facteur de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique 10-2

N= NPP /V inoculum * Fd

15/0,01 =15 102  micro-organismes par mL