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La spectrométrie de masse
Mass Spectrometry ou MS est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse et de caractériser leur structure chimique.
Histoire:
- En 1910, le britanique Joseph John Thomson conçoit la technique de spectrométrie de masse et met en évidence l'existence d'isotopes stables du néon.
- En 1918, Arthur Jeffrey Dempster construit un spectrométre de masse à secteur magnétique.
- En 1942, commercialisation du premier appareil.
- En 1949, Herzog et Viehbok élaborent la spectrométrie de masse à ionisation secondaire connu sous le nom de SIMS (Secondary Ion Mass spectromtry).
- En 1959, Roland Gohlke réalise le premier couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectromètrie de masse CG-SM.
- En 1980, le thermospray.
- En 1981, mise en place d'une technique de ionisation par bombardement d'atomes rapides connu sous le nom de FAB.
- En 1985, Hillenkamp découvre le MALDI (matrix-assisted-laser-desorption-ionization) qui permet d'effectuer le séquençage de peptides.
- En 1988, Fenn découvre la méthode d'ionisation électrospray qui permet les mesures de hautes masses moléculaires de peptides.
Principe:
Un composé organique introduit dans le spectromètre de masse est ionisé par bombardement électronique à 70eV. L'ion ainsi obtenu , appelé ion moléculaire, permet la détermination de la masse molaire du composé. Il peut y avoir des ruptures des liaisons chimiques au sein de l'ion moléculaire, formant ainsi des ions fragments caractéristiques puisque cette dissociation éventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mécanismes bien déterminés. Ces ions fragments sont ensuite séparés en fonction de leur rapport masse/charge par l'application d'un champ magnétique et/ou électronique, puis collectés par un détecteur. L'ensemble des ces ions fragments constitue le spectre de masse dont la lecture permet l'identification de la structure moléculaire.
La composition de base d'un spectromètre de masse:
- Un système d'introduction de l'échantillon
- Une source d'ions ou chambre d'ionisation
- Un analyseur qui sépare les ions en fonction de leur masse et de leur charge
- Un détecteur qui détecte les ions sortant de l'analyseur
Chacun de ces élèments étant dans les conditions de vide.
- La première étape consiste à:
introduire l'échantillon dans la source d'ion. Cette introduction dépendra de l'état physique de l'échantillon (gaz, solide ou liquide).
- Pour les gaz et les liquides volatils, l'introduction s'effectue a l'aide d'un ballon chauffé mis en relation avec la source d'ion.
- Pour les solides, on utilisera une canne d'introduction possédant un filamment sur lequel on déposera l'échantillon préalablement dissout dans un solvant organique. L'échantillon peut être également introduit par un système séparatif comme la chromatographie en phase gazeuse, liquide, ou électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse.
- La deuxième étape consiste à:
vaporiser les molécules et à les ioniser. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs type de sources existent et sont utilisées en fonction du résultat recherché et des molécules analysées.
- L'impact électronique (EI-MS) consiste à obtenir, sous vide , l'interaction d'une molécule et d'un électron accéléré à quelques dizaines de volts.
- La ionisation chimique (CI-MS) est une méthode qui utilise un gaz réactif (à la pression d'environ 1 mm Hg) qui est ionisé par un faisceau d'électrons et donne une série d'ions qui à leur tour réagissent avec les substances à analyser. On peut utiliser divers gaz, parmi lesquels l'ammoniac, le méthane et l'isobutane.
- L'electrospray est une technique qui permet de désolvater et d'ioniser, sous pression atmosphérique, les molécules d'échantillons dissoutes dans un solvant sous l'influence d'un champ électrique.
- La spectrométrie de masse à ions secondaires avec cible liquide (L.S.I.M.S) est une technique de désorption-ionisation par des ions rapides (Cs+ accélérés à 30kV) en présence d'une matrice liquides.
- Le bombardement par atomes rapides (F.A.B) est une technique dont le matériau à analyser est dissou dans une matrice liquide puis bombardé sous vide avec une énergie élevée par un faisceau d'atomes.
- La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est une technique permettant de ioniser un échantillon solide préalablement dispersé dans une grande quantité de matrice en l'irradiant par des photons émis par un laser dont la longueur d'onde est située dans la bande d'absorption de la matrice.
- La troisième étape consiste à l'analyse:
L'analyseur quadripolaire est constitués de 4 barres parallèles ayant idéalement une section hyperbolique, disposées symétriquement autour d'un axe. Ces 4 barres sont associées électriquement 2 par 2 et créant ainsi un champ électrique d'oscillation laissant passer certaines masses tandis que d'autres sont sur une trajectoire instable ne leur permettant pas d'atteindre le détecteur. Le quadripôle est donc un filtre de masse.
L'analyseur à piégeage d'ions est un quadripôle à 3 dimensions constitué d'une électrode annulaire et de 2 électrodes "chapeaux" de sections hyperbolique. Le mouvement des ions en 3 dimensions à l'intérieur du piège dépend de la masse m de l'ion, ainsi que de sa charge Z. Il existe des zones de stabilité dans lesquelles des ions de masse m peuvent avoir un mouvement vibratoire stable et donc rester piégés dans la trappe ionique. Les ions sont d'abord tous piégés à l'intérieur de la trappe, confinés dans une certaine gamme de masse puis éjectés sélectivement en direction du détecteur. Le spectre de masse est obtenu en augmentant progressivement la tension pour destabiliser les trajectoires des ions en fonction de leurs masses croissantes.
L'analyseur à temps de vol (time-of-flight, TOF-MS) est un système qui utilise la désintégration d'atomes de 252Cf (isotope de californium qui est un puissant émetteur de neutrons ce qui le rend particulièrement dangereux. Chaque microgramme de 252Cf émet spontanément 2 314 000 neutrons par seconde) qui peuvent dans 3% des cas se désintégrer en deux particules Tc (Technétium) et Ba (Baryum) émises simultanément et dans deux directions opposées. L'une des deux est immédiatement détectée et donne un signal de départ, tandis que l'autre frappe une "cible" sur laquelle est déposé l'échantillon. Celui-ci va alors émettre de 1 à 10 ions secondaires, qui vont se déplacer à une vitesse inversement proportionnelle à la racine carrée de leur masse. Le temps qu'ils mettent pour atteindre le détecteur (= leur temps de vol) permet donc de déterminer la masse des ions.
- Avantage:
Cet analyseur offre la possibilité unique de détecter la présence simultanée d'un grand nombre de composés en mélange.
- Limites:
La transmission, l'efficacité de détection décroît avec la vitesse pour les ions de haut poids moléculaire.
Cet technique nécessite de disposer d'un mode de production des ions impulsionnel afin de déclencher la mesure des temps de vol.
Les avantages de la spectrométrie de masse:
- Sa versatilité
- Sa sensibilité
- Sa capacité à être couplée aux techniques séparatives
Les inconvénients de la spectrométrie de masse:
La mesure de masse ne peut être effectuée que sur la molécule isolée, il est donc nécessaire de transformer un échantillon généralement liquide ou solide en gaz dilué nécessitant un vide poussé.
Secteurs professionnels utilisant cette technique:
- Hôpitaux
- Musée (permet de mettre en évidence la présence d'huiles, de cires, de résines terpéniques, de gommes polysaccharidiques et de colles animales, à partir de micro-prélèvements effectués sur des œuvres d'art).
- Aéroports
- Laboratoires
- Polices scientifiques
- Archéométrie (datations; analyses élèmentaires et isotopiques; identifications de matériaux organiques complexes).
Son utilisation:
- Identification :
- Suivant le type d'ionisation utilisé, un spectre de masse peut être caractéristique d'une molécule. Ainsi en le comparant avec des banques de spectres, il est possible d'identifier la molécule.
- Lors de l'utilisation d'un analyseur haute résolution (TOF, secteur magnétique, FTICR, Orbitrap), la spectrométrie de masse permet de mesurer avec précision la masse monoisotopique d'un ion et d'en déduire sa formule brute.
- Analyse structurale :
- La parité de la masse mesurée est fonction de la parité du nombre d’atomes d’azote que possède une molécule (règle de l’azote).
- Chaque atome possède un ou plusieurs isotopes qui sont de masses différentes par définition. Ainsi, la proportion de chaque isotope observé sur un spectre de masse, c'est-à-dire le massif isotopique, est caractéristique de la présence de certains atomes et de leur nombre dans l'ion mesuré (en particulier: Cl, Br, qui présentent des isotopes M et M+2 en quantité notable).
- Les ions peuvent se fragmenter dans un spectromètre de masse : dans la source d'ionisation, dans l'analyseur ou dans une cellule de collision. Comme les fragmentations respectent des lois précises de chimie en phase gazeuse, l'étude de ces fragments permet de déterminer la structure des ions.
- La parité de la masse mesurée est fonction de la parité du nombre d’atomes d’azote que possède une molécule (règle de l’azote).
- Quantification :
- Un spectromètre de masse est un détecteur universel et très sensible. Sa gamme linéaire va de 3 à 7 ordres de grandeur, d'où la possibilité d'obtenir une quantification fiable sur un domaine large.
le test des comètes
Elle fut ensuite optimisée par Singh et all en 1988 afin de détecter les cassures simples brins et les sites alcali-labiles. L'électrophorèse, dans ce cas présent, se réalise dans des conditions fortement alcalines afin de relaxer et de détendre l'ADN superenroulé.
Principe:
Mode opératoire:
Les cellules après un contact avec un agent altérant la structure de l'ADN (isotopes, agents oxydants ou autres molécules toxiques) pendant un temps donné sont décollées de leur boite de pétri pour y être englobées dans un gel d'agarose et déposées sur une lame de microscope. Elles sont ensuites soumises à l'action d'un agent alcalin (pH 10) qui a pour effet de lyser les cellules (destruction des membranes, des protéines et des ARNs) et de libérer les noyaux. Ces derniers sont ensuite incubés dans un tampon d'électrophorèse basique (pH 13) pour faciliter la dénaturation, la détorsion de l'hélice et l'exposition des sites sensibles aux agents alcalins. L'ADN ainsi relaché, est soumis à une électrophorèse (de faible voltage et ampérage) puis révélé par addition d'un intercalant fluorescent (le Bromure d'éthydium).
Si l'ADN n'a pas été endommagé (reste sous forme super enroulé) sera révélé sous forme d'une sphère compacte.
Si l'ADN a été endommagé, celui-ci présentera en plus des fragments simples et doubles brins (plus légers) qui migreront en dehors de cette sphère formant un "halo" d'ADN qui s'étirent en direction de l'anode et décrivent la queue de la comète.
avantages:
- Cette technique permet de quantifier d'une part les dommages causés à l'ADN par divers agents toxiques et d'autre part la réparation des dommages dans les cellules eucaryotes ainsi que dans quelques cellules procaryotes in vivo et in vitro.
- Technique non invasive.
- Technique sensible (détection d'environ 0,2 à 2 coupures par 109 daltons).
- Les résultats sont obtenus en quelques heures par rapport aux techniques conventionnelles.
- 50 à 100 cellules sont comptées par échantillon par comptage manuel ou en utilisant un logiciel.
inconvénients:
- Le débit de cette technique est bas, car une électrophorèse correspond à un type cellulaire / un agent toxique / une concentration.
- Les résultats ne peuvent être comparés que s'ils proviennent d'électrophorèses réalisées ensembles.
- Evaluation des produits chimiques génotoxiques in vivo et in vitro.
- Etude sur la réparation de l'ADN (réparation par excision; Strand Break Repair).
- Etude sur les dommages causés à l'ADN (cassure simple brin; sites alcali-labile; réticulation de l'ADN).
- En éco-toxicologie: test utilisé pour surveiller des sols et étudier la toxicologie aquatique.
- Evaluation des polluants génotoxiques provenant de sites de déchets dangereux.
- Epidémiologie de l'homme:
- Banque de sang.
- Suivi de la radio et chimio-thérapie chez les patients cancéreux.
- Banque de sperme.
Le test d'Ames pour évaluer le pouvoir cancérigène d'une substance
Histoire:
Ce test biologique fut décrit en 1973 par Bruce Ames.
Intérêt:
L'apparition d'un cancer est souvent lié à des dommages causés dans l'ADN. Ce test permet d'estimer le potentiel cancérigène d'une substance.
Principe:
Le test d'Ames évalue la facilité qu'une substance induise une réversion dans l'expression des gènes pour l'histidine sur des souches bactériennes mutagènes de Salmonella typhimurium. La mutation rend les bactéries auxotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent se développer que dans un milieu possédant cet acide aminé contrairement aux bactéries sauvages (prototrophes) qui poussent dans un milieu qui en est dépourvu. On cherche l'apparition de souches mutantes.
Pour s'assurer que la réplication de l'ADN puisse se faire en présence du mutagène potentiel, les bactéries et la substance analysée sont mélangées dans de l'agar mou auquel on ajoute de faibles quantités d'histidine. Cet agar mou est ensuite étalé à la surface de boîtes d'agar réalisées avec un milieu minimum. Les boîtes sont incubées 2 à 3 jours à 37°C. Les cellules auxotrophes pour l'histidine pousseront quelques heures jusqu'à épuisement de l'histidine du milieu d'agar mou. Seules les révertants, ayant retrouvé la capacité à synthétiser de l'histidine, seront ensuite capables de se développer sur ce milieu minimum. Les colonies sont ensuite dénombrées et la valeur obtenue sera comparée à un témoin afin d'estimer le pouvoir mutagène relatif de la substance vis-à-vis de ces souches auxotrophes pour l'histidine.
Particularité des souches bactériennes:
- Les bactéries doivent posséder un caractére provoquant la formation de parois dépourvues d'un lipopolysaccharide rendant les cellules perméables à de nombreuses substances.
- Les bactéries sont déficientes dans leur système de réparation de l'ADN par excision et possédent des gènes plasmidiques favorisant un fort taux de mutation lors de la réparation de l'ADN.
Particularité du milieu de culture:
méthode simple, sensible et précise.
Ce test peut également s'appliquer à l'analyse d'effluents industriels, d'eau à usage alimentaire, de fumées ou de gaz d'échappement, de liquides biologiques humains (urines, fécès) provenant d'individus mis en contact par leur travail avec des produits cancérogènes. Les médicaments et leur principe actif peuvent aussi faire l'objet d'un examen systèmatique par ce test.
Inconvénient:
Ce test utilise des bactéries. Celles-ci ne présentent pas un modèle parfait pour l'homme.
La cytométrie en flux (CMF)
Premier cytométre commercialisés.
Principe:
La suspension cellulaire à analyser est injectée sous pression au centre d'une gaine liquide préssurisée. Les cellules vont être contraintes de s'y centrer et vont ainsi traverser individuellement le faisceau laser focalisé sur l'axe du jet. Les méthodes de mesure sont basées sur l'absorption et la diffusion du rayon laser par la cellule, la fluorescence émise par les flurochromes fixés et la forme du signal détecté.
- La cellule, après interception de la lumière incidente (rayon laser) réemet dans divers directions une partie de la lumière sous forme de signaux représentatifs de la taille et de la granulosité de la cellule. Il est ainsi possible par exemple de distinguer les lymphocytes, des monocytes et des polynucléaires, de différencier les cellules vivantes des cellules en apoptose et de mettre en évidence la phagocytose.
- L'émission de fluorescence peut être spontanée mais le plus souvent apporté à la cellule par un ou plusieurs fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée sous forme de photons d’une longueur d’onde plus élevée. Elle permet de renseigner sur les propriétés cellulaires. Il est ainsi possible de réaliser des mesures d'ADN, d'ARN, de protéines, de calcium. Associé à un anticorps ou à un ligand spécifique, le fluorochrome permet de quantifier et de réaliser une étude fonctionnelle de récepteur à la surface cellulaire.
Les signaux ainsi émis sont focalisés, séparés par une alternance de miroirs et de filtres optiques, en fonction de leur longueur d'onde. Ils sont ensuite amplifiés et transformés en impulsions électriques par les photomultiplicateurs puis digitalisés pour être utilisés par l'unité informatique.
La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement des sous populations définies par leurs propriétés optiques à partir d'une population hétérogène.
Le tri cellulaire permet de purifier d'éliminer des cellules mortes d'une culture et de faire du clonage en plaçant une cellule par puits dans une plaque de culture.
- Etude quantitative de nombreuses caractéristiques (présence d'un antigène, quantité d'ADN ou d'ARN, activité enzymatique etc...).
- Analyses précises sur des critères très différents et très nombreux.
- Séparation des cellules avec une très grande pureté en condition stérile.
- N'abime pas les cellules.
Inconvénients:
- Les cellules doivent être en suspension.
- Le nombre de cellules doit être de l'ordre de quelques centaines de milliers au minimum.
- Pas d'image des cellules analysées.
- L'analyse étant qu'à un unique instant donné, on ne peut pas faire de véritable étude cinétique portant sur une même cellule.
Principaux secteurs utilisant cette technologie:
Hématologie
Cancérologie
Immunologie
Pharmacologie
Océanographie
Physiologie végétale
Intérêts d'application:
- Analyse de constituants ou compartiments cellulaire: ADN, ARN, protéines, expression d'antigénes (membranaires ou intracellulaires), enzymes, hormones.
- Analyse d'activités cellulaire (modification du pH, du Ca2+), métabolisme oxydatif, potentiel membranaire.
les milieux sélectifs en microbiologie
- La température d'incubation
- Le pH du milieu
- La faculté d'utiliser une source nutritive déterminée (azote, carbone)
- La résistance à l'action bactéricide d'un antiseptique ou d'un antibiotique
Le milieu Chapman:
Composition d'un litre de milieu:
- Peptone 10g
- Extrait de viande de boeuf 1g
- Chlorure de sodium 75g
- Mannitol 10g
- Rouge de phénol 0,025g
- Agar-Agar 15g
- Eau distillée qsp 1litre
- pH = 7,4
Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du mannitol comme source de carbone et d'énergie.
Il est mis en évidence grace à un indicateur coloré de pH: le rouge de phénol.
- Si le milieu reste rouge, les colonies sont mannitol- car elles ne fermentent pas le mannitol, légère alcalinisation du milieu par l'utilisation de peptones dans leur métabolsime énergétique.
- Si le milieu devient jaune, les colonies sont mannitol+ car elles fementent le mannitol dans leur métabolisme énergétique avec acidification du milieu.
Le milieu EMB (milieu éosine bleu de méthylène):
Ce milieu est utilisé pour isoler et identifier Escherichia coli et Enterobacter ainsi que les bactéries intestinales à Gram -.
Histoire:
Préparation pour 1 litre de milieu:
- peptone pancréatique de gélatine : 10 g
- phosphate dipotassique (PO4 K2H) : 2 g
- lactose : 10 g
- éosine jaune : 0,4 g
- bleu de méthylène : 0,065 g
- agar agar : 15 g
- pH: 6,8
Lecture:
Escherichia coli:
Enterobacter aerogenes:
Colonies bleuâtres à centre brun foncé, aplaties, plutôt confluentes, de 4 à 6 mm de diamètre qui ne présentent qu'occasionnellement un éclat métallique.
Citrobacter:
Colonies violettes à leger reflet métallique.
Klebsiella:
Colonies brunâtres, muqueuses.
Salmonella et shigella:
Colonies ambrées, transparentes.
Produits contrôlés par ce milieu:
- Produits pharmaceutiques
- Produits laitiers et alimentaires
- eaux
La gélose Salmonella-Shigella (S.S.):
La gélose Salmonella-Shigella (S.S.) est utilisé pour l’isolement sélectif des Salmonella et des Shigella dans les prélèvements cliniques (selles) et les denrées alimentaires.
Préparation pour un litre d'eau distillée ou déminéralisée:
| Protéose peptone | 5 g | | Citrate ferrique ammoniacal | 1 g |
| Extrait de viande de bœuf | 5 g | | Thiosulfate de sodium | 8,5 g |
| Lactose | 10 g | | Rouge neutre | 0,025 g |
| Sels biliaires N° 3 | 8,5 g | | Vert brillant | 0,00033 g |
| Citrate de sodium | 8,5 g | | Agar | 13,5 g |
pH final à 25°C : 7,0 ± 0,2
- les agents inhibiteurs sont les sels biliaires, le vert brillant et le citrate de sodium. Ils empéchent la pousse de toutes bactéries Gram+ et rendent difficile la croissance des bactéries Gram- autre que Salmonella et Shigella.
- Le milieu contient du thiosulfate pouvant donner du H2S. Celui-ci est révélé par le citrate ferrique.
- Le milieu contient du lactose pouvant être fermenté. La fermentation est révélée par le virage de l'indicateur coloré, le rouge neutre à sa teinte acide.
Lecture:
Les colonies caractéristiques de Salmonella (lactose négatif) sont opaques, translucides ou transparentes et généralement avec un centre noir (H2S positif).
Les colonies caractéristiques de Shigella (lactose négatif) sont incolores.
Les coliformes qui réussissent à pousser sur ce milieu sont rose-rouge (lactose positif).
Transfert de gène dans les cellules eucaryotes
- Isolement , clonage et séquençage du gène,
- manipulation in vitro sur le gène provoquant des mutations,
- réintroduction du gène modifié dans les cellules pour étudier sa fonction. On qualifie cette réintroduction sous le terme de transfection cellulaire.
L'intérêt d'étudier la fonction d'un gène est multiple:
permet d'identifier des séquences régulatrices (emplificateur),
La thérapie génique.
Les obstacles à une telle étude sont:
les cellules normales n'ont pas une tendance à se multiplier à haute fréquence. Ce dernier fut résolu grâce aux lignées cellulaires qui possèdent la particularité de se multiplier rapidement et indéfiniment. ces cellules dérivent de lignées tumorales. Elle présentent néanmoins des propriétés différentes aux cellules normales.
On peut également utiliser des cellules immortalisées. Ce sont des cellules normales traitées de façon qu'elles se multiplient rapidement.
Différents types de traitement pour immortaliser les cellules:
- Par un oncogène,
- Par un virus (polyome, SV40, virus du Sarcome de Rous, virus d'Epstein-bar...).
- Par un produit chimique tel qu'un agent mutagène (nitrosoguanidine, méthanesulfonate d'éthyl...).
Le transfert de gènes:
- L'électroporation: les cellules sont soumis à un champ électrique. Les impulsions électriques produisent un potentiel transmembranaire provoquant une rupture réversible de la membran cellulaire. Des pores se forment et permettent au plasmide de pénétrer dans la cellule.
- La micro-injection directe de l'ADN grâce à des micro-pipettes. Cette méthode est lourde à entreprendre sachant qu'un fragment d'ADN doit être injecté dans 100 cellules eucaryotes.
- Association de l'ADN et d'une colonne DEAE (diéthylaminoéthyl). Ce géle montre des charges positives permettant de fixer l'ADN (chargé négativement). On introduit ensuite les cellules dans cette colonne et on provoque un choc thermique. Des pores apparaissent dans la membrane plasmique de ces cellules permettant l'introduction de l'ADN. Beaucoup de cellules sont réfractaires à ce système.
- Utilisation du phosphate de calcium: l'ADN étranger se trouve en solution avec du phosphate de calcium. Cet ADN va alors co-précipiter avec les cristaux tricalciques, et ainsi être protégé des nucléases. De plus cette précipitation à l’avantage d’augmenter le contact avec les cellules cibles. Ce contact entre la cellule et le co-précipité va induire une endocytose, et ainsi permettre l’introduction de l’ADN étranger dans la cellule cible. Cette technique est relativement simple à réaliser. Son rendement est bon mais elle acidifie le milieu de culture, et peut être toxique à plus ou moins long terme.
- Utilisation de liposomes qui sont des vésicules artificielles formées par des bicouches phospholipidiques. Ils mesurent quelques dizaines à quelques milliers de nm de diamètre. L'association avec l'ADN se fait par interaction électrostatique entre les groupes phosphates de l'ADN chargés négativement et les têtes polaires des lipides cationiques chargées positivement. On obtient un vecteur qui au contact des cellules, pénétre dans celles-ci. La pénétration intracellulaire reste pour le moment mal connue. En dehors de l'endocytose, d'autres mécanismes semblent possibles. Dans le cytoplasme de la cellule, le liposome se dissocie, libérant l'ADN. L'utilisation des liposomes présente des inconvénients importants, le rendement faible de la pénétration intracellulaire et dans le noyau (transfection stable).
Les cellules eucaryotes infectées par un virus sont facilement observables car elles produisent des particules virales.
Dans le cas d'une transfection par le biais d'un plasmide:
Ce gène est associé au gène de la beta globine servant de site de restriction pour l'enzyme KPN1.
L'ensemble est ensuite mis en contact avec des cellules déficientes pour le gène TK (paramétre limite) et en présence de phosphate de calcium (transfection cellulaire).
Les cellules poussent dans un milieu sélectif. Seules les cellules possédant le gène TK poussent c'est à dire les cellules transfectées.On obtient des clones que l'on sépare. On procède ensuite a l'extraction de l'ADN de ces clones.
L'ADN ainsi prélevé, on procède à sa digestion en utilisant l'enzyme de restriction KPN1 qui coupe au niveau du gène de la globine. On obtient des fragments d'ADN. Ceux-ci sont séparés par électrophorèse puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. On procède enfin à l'hybridation moléculaire en utilisant une sonde radioactive de la beta globine (technique du southern blot).
Cette technique ne s'adresse qu'aux cellules déficientes pour le gène TK.
On crée un plasmide avec le gène aph, le gène d'intérêt et un promoteur. Ce plamide est ensuite mis en contact avec les cellules en culture. Le plamide pénétre dans quelques cellules. La transfection peut soit être stable ou transitoire.
- Dans le cas d'une transfection stable, les rares cellules transfectées qui intégrent l'ADN exogène dans leur génome sont selectionnées sur un milieu contenant du G418 (les autres cellules non transfectées meurent). Ces cellules ayant subi une transfection stable continueront à produire la protéine codée par l'ADNc tant que la culture sera maintenue.
- L'obtention des transfectants stables n'est pas toujours évident d'où le passage à des transitoires. Dans ce cas là, on ne laisse pas le temps au plasmide de s'intégrer au génome. On lyse les cellules et on récupére leur contenu.
- En 48 heures de culture, on a suffisament d'ARN synthétisé par le gène exogène.
Il convient d'utiliser un vecteur d'expression efficace. Il doit contenir:
- Un gène de la résistance à l'antibiotique à l'ampicilline.
- Un promoteur puissant comme le promoteur du gène précoce du cytomégalovirus humain (CMV).
- Un gène d'intérêt intégré au niveau du polylinker.
- Une séquence de meilleur arrêt de transcription.
- Un séquence de meilleur traduction.
- Une séquence intronique ( utilisée par la machinerie cellulaire lors de la maturation) afin d'assurer une meilleure transcription.
L'expression d'un gène dépend de son promoteur. Si le promoteur n'est pas fort, la transcription reste difficile à détecter.
A ce promoteur faible, on ajoute un gène rapporteur ("reporter"). Quand le gène rapporteur sera exprimé en ARNm puis traduit en protéine, cette dernière sera facilement détectable par des tests. On pourra déterminer le taux de la protéine et donc en déduire la force du promoteur.
Exemple de gène rapporteur:
Le gène CAT (Chloremphenical Acetyl Transférase). Ce gène code pour une enzyme qui transfecte l'acétyl sur le chloremphenical.Le plasmide possédant le promoteur a étudier et le gène rapporteur est mis en contact avec les cellules en culture. Après 48h, on lyse les cellules par des cycles de congélation/décongélation. Ces lysats sont ensuite mélangés avec du chloramphenical radioactif et de l'acétyl coenzyme A. L'enzyme Chloremphenical Acetyl Transférase transfére le groupe acétylé de l'acétyl CoA sur les positions 2 ou 3 du chloramphenical. La réaction est suivie par chromatographie en couche mince qui permet de séparer le chloramphenical acétylé de la forme non acétylé. les formes de chloramphenical acétylé montent plus haut que la forme non acéthylé.
On visualise les produits de la réaction par autoradiographie.
on observe un seul signal correspondant au chloramphenical non acetylé traduisant que le promoteur n'est pas actif et 3 signaux correspondant aux 2 formes acétylés et la forme non acétylé du chloramphenical.
On notera que plus le signal autoradiographique est fort et plus la transcription est fort. Ceci traduit l'activité réelle du promoteur.
On peut également utiliser comme gène rapporteur, le gène de la luciférase. Il code pour une enzyme la luciférase qui à la particularité d'oxyder la luciférine (substrat) aboutissant à la formation d'oxyluciférine et à l'émission de photons. On utilisera dans ce cas, un appareil capable de détecter la bioluminescence.
L'amplification génétique:
La transfection stable peut être également utilisée afin de réaliser de très nombreuses copies du gène d'intérêt.
On réalise dans ce cas, un plasmide comprenant le gène d'intérêt et le gène DHFR qui code pour le dihydrofotate réductase. C'est une enzyme importante pour la réplication de l'ADN et donc pour la survie des cellules.
On transfecte ce plasmide dans des cellules DHFR-. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu dépourvu de nucléosides. Les cellules meurent sauf celles qui contiennent dans le génome, le gène DHFR et le gène d'intérêt (transfection stable). Des clones apparraissent. Ceux-ci sont récupérés puis mis en culture afin d'augmenter leur quantité. On dépose du méthotrexate (inhibiteur de la DHFR) à faible dose dans le milieu. Un grand nombre de cellule meurent. Les cellules qui ont pu résister sont remis en culture. L'analyse de l'ADN de ces cellules dévoile une amplification génétique du gène DHFR et des régions voisines dont le gène d'intérêt. On procéde à chaque étape de culture à l'augmentation progressive de la concentration du méthotrexate afin d'obtenir une succession de copie du gène DHFR et du gène d'intérêt.
La CHROMATOGRAPHIE (2.0)
Quand une solution protéique non purifiée traverse la colonne, la protéine désirée se lie à l'effecteur, tandis que les autres composants sont élués. La récupération de la protéine désirée est ensuite obtenue par des modifications de la phase mobile. Ces modifications concernent le tampon pH, le tampon de force ionique ou l'ajout d'un compétiteur:
- le tampon pH différent de celui qui a permis la fixation de la protéine à isoler provoque un changement de l'état d'ionisation de celle-ci provoquant sa désorption.
- le tampon de force ionique différent de celui qui a permis la fixation de la protéine à isoler provoque un changement de la conformation de la protéine.
- l'ajout d'un compétiteur (effecteur libre).
Selon le type de molécule fixée sur le support, on peut distinguer 3 types d'affinités:
- l'utilisation comme effecteur un substrat, permet d'entreprendre une sélection d'enzyme.
- l'utilisation comme effecteur un ligand, permet d'entreprendre une sélection de recepteur.
- l'utilisation comme effecteur un anticorps, permet d'entreprendre une sélection d'antigène.
Les groupes hydroxyles (OH) du support d'agarose réagissent avec le bromure de cyanogène pour donner un intermédiaire "activé" et stable (cette manipulation ce réalise à l'aide d'une solution dont le pH est finement contrôlé (pH8,3)), ainsi des groupements imidocarbonate se forment permettant la fixation de l'effecteur contenant des amines libres.
Beaucoup de protéines sont incapables de se fixer à leurs effecteurs couplés au bromure de cyanogène, a cause d'interférences stériques d'où un problème d'accessibilité avec la matrice d'agarose. On utilise dans ce cas là, un bras espaceur qui se place entre le support et l'effecteur.
Avantage:
La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective.
Inconvénients:
La chromatographie d'affinité est une méthode coûteuse et délicate à mettre en oeuvre:
- la fixation de l'effecteur à la matrice ne doit pas (ou peu) modifier l'affinité de celui-ci vis à vis de la macromolécule cible.
- l'affinité effecteur-macromolécule doit être suffisamment forte pour permettre la fixation, mais pas trop pour que l'on puisse, ensuite, dissocier la liaison et éluer la protéine sans la dénaturer.
- dans le cas d'un isolement d'une enzyme, il est important de veiller à ce que les conditions chromatograhiques ne permettent pas à cette enzyme d'être fonctionnelle, risquant ainsi de transformer l'effecteur.
La chromatographie d'échange d'ions:
Histoire:
Grâce à cette méthode, lls ont pu déterminer le site actif de la Ribonucléase bien avant que l'on puisse établir sa structure tridimentionnelle. Ils ont ainsi montré que ce site était constitué de 2 résidus spécifiques de l'histidine.
Cette méthode repose sur la différence d'interraction entre les molécules chargées à séparer et la phase stationnaire.
La phase stationnaire:
La phase stationnaire est constituée d'un support macromoléculaire chimique comme le dextrane, la cellulose ou le gel de polyacrylamide sur lequel sont greffés par liaison covalente des groupements soient acides, susceptibles de se charger négativement lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH est supérieur à leur pKa . Il s'agit alors d'échangeur de cations.
Soient basiques, susceptibles de se charger positivement lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH est inférieur à leur pKa. Il s'agit alors d'échangeur d'anions.
Notons que les groupements d'acide ou de base forte sont ionisés quel que soit le pH de la solution tampon.
Exemple de groupement d'acide faible: le carboxyméthyl au pKa de 4.
Exemple de groupement de base faible: le diethylaminoéthylammonium au pKa de 9,5.
Exemple de groupement d'acide fort: La résine sulfonique.
Exemple de groupement de base forte: l'ammonium quaternaire
L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs facteurs:
• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépend :
- de leur nature (pKa)
- du pH de la solution
• de la densité de charge de l'ion considéré, qui dépend:
• de la concentration des ions- de la charge de cet ion c'est-à-dire :
- de la nature de l'ion (pKa, pHi)
- du pH de la solution
- de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fixé qu'il est chargé, ou/et qu'il est petit)
• de l'accessibilité des groupements fonctionnels
La chromatographie d'échange d'ions se réalisent en 4 étapes:
Deuxième étape: dépot des molécules à séparer sur la colonne. La solution est dans le même tampon de pH qui a permis de ioniser l'échangeur d'ions.
Troisième étape: élution des molécules fixées sur la résine soit en modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions). Il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine. Soit, en ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine: cet ion s'appelle un contre-ion.
L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant:
- cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+
- cations divalents : Cd2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ca2+
- de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca2+ < Al3+
Cl- ; HO-
Les applications de la chromatographie d'échange d'ions :
Quelques exemples d'application :
- l'analyse des eaux usées, des eaux de surface et souterraines
- la caractérisation de solutions du sol et d'extraits de litières
- le dosage des anions adsorbés sur la surface des minéraux du sol, en vue de caractériser leur propriétés de charge de surface et leur affinité sélective pour certains ions
- l'analyse des gaz et eaux d'origine volcanique
La CHROMATOGRAPHIE
Historique:
On trouve la première réfèrence d'un processus chromatographique dans l'Ancien Testament qui fait mention de propriétés adsorptives de certaines variétés de bois pour adoucir de l'eau amère. Ce sont les tanins hydrophobes qui constituaient une phase stationnaire apolaire (Chromatographie d'adsorption).
Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Les phénomènes mis en jeu révèlent ici de l'échange d'ions.
En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT inventa la chromatographie par adsorption. Il procéda de la manière suivante:
Il verse dans une colonne de verre remplie de carbonate de calcium finement pulvérisé un extrait de feuilles vertes à l'éther de pétrole, puis il ajoute une certaine quantité du même solvant pur. Il constate ainsi, que le pigment végétal, d'abord retenu au sommet du récipient, se divise en plusieurs zones en descendant le long de la colonne, à des vitesses différentes, à mesure que le solvant s'écoule au travers du carbonate de calcium, produit adsorbant retenant les substances à sa surface. Ainsi apparaissent successivement une zone jaune pâle d'allure lente, deux zones vertes et trois jaune. Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de chromatographie (du grec Khrôma, couleur et graphein, écrire) définit comme l'enregistrement graphique des couleurs.
En 1941, Archer John Porter MARTIN et Richard Laurence Millington SYNGE publient la théorie de la chromatographie de partage sur gel de silice:
En 1938, afin d'étudier les acides aminés constituant la laine, ils réalisent des travaux sur la distribution des acétyl-amino-acides entre l'eau et le chloroforme. Ils imaginent ainsi un dispositif d'extraction fractionnée. La phase aqueuse est fixée à demeure sur une colonne de gel de silice qui peut retenir de 50 à 100% de son poids d'eau. Sur cette colonne, il fait traverser une solution des composés à séparer, en l'occurrence des dérivés acétylés d'acides aminés mélangés avec du chloroforme et du butanol.Il réalisent ensuite des extractions successives.
1944 CONSDEN, GORDON et MARTIN inventent la chromatographie de partage sur papier (le papier servant de support de la phase stationnaire) . Le principe consiste à plonger l'extrémité d'une bande de papier filtre dans un solvant organique saturé d'eau. On dépose à cette extrémité une goutte de la solution à analyser : par capillarité, la phase mobile avance sur le papier. Au fur et à mesure que le solvant progresse, les constituants du soluté se répartissent suivant leur coefficient de partage entre le solvant et l'eau retenue par la cellulose du papier.
Principe:
La chromatographie est une technique analytique qui permet la séparation des constituants d'un mélange en phase homogène liquide ou gazeuse.
Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire (emprisonnée dans la colonne) et la phase mobile (l'éluant) qui se déplace.
La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants présents dans la colonne. Ces derniers la parcourent avec des temps proportionnels à leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, ...). A leur arrivée en bout de colonne, le détecteur mesure en continu la quantité de chacun des constituants du mélange.
Le type de support utilisé pour la séparation des constituants d'un échantillon permet de distinguer plusieurs types de chromatographie:
La chromatographie d'absorption (interraction chimique)
La chromatographie de partage (solubilité dans l'une des 2 phases)
La chromatographie d'affinité (reconnaissance par forme)
La chromatographie d'échange ionique (force ionique)
La chromatographie de filtration (exclusion par taille)
La chromatographie d'adsorption:
On la définie également comme une chromatographie solide-liquide car elle est basée sur une séparation des solutés au moyen de 2 forces opposées:
La rétention par adsorption sur la phase stationnaire.
L'entrainement par le courant de l'éluant sur la phase mobile.
L'adsorption est un phénomène de surface lié à la polarité des molécules.
Lors du passage du soluté, des interractions polaires s'effectuent entre celui-ci et la silice tandis que l'éther de pétrole (apolaire) passe sans éluer la molécule du soluté.
Exemple d'application:
La technologie CCM ou chromatographie sur couche mince.
Avantage:
Simple et rapide à mettre en oeuvre
Coût faible
Analyse qualitative uniquement
Principe:
On utilise pour la phase mobile un solvant ou un mélange de solvants et pour la phase stationnaire un adsorbant (comme une couche d'environ 0,25mm de géle de silice, l'alumine, le kieselguhr ou la cellulose) avec un liant (comme le sulfate de calcium hydraté, l'amidon ou un polymère organique) permettant ainsi la fixation de celui-ci sur une plaque de verre, d'aluminium ou de plastique. L'échantillon (environ un microlitre de solution diluée (2 à 5%) du mélange à analyser) est déposé ponctuellement sur la plaque. Les constituants de l'échantillon sont élués par la phase mobile qui grimpe par capillarité vers le haut de la plaque. Ils peuvent être identifiés par comparaison avec l'élution simultanée de témoins.
Protocole expérimental:
La préparation de l'échantillon se fait par l'intermédiaire de solvants volatils qui peut être différent de l'éluant. Les solvants les plus utilisés sont le chloroforme, la propanone et le dichlorométhane.
Le dépot de l'échantillon se fait en un point de la plaque situé à environ 1cm de la partie inférieure à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en appuyant légèrement et briévement l'extrémité de la pipette sur la couche adsorbant. Le dépot ne doit pas dépasser 3mm de diamétre.
Préparation de la cuve et mise en place de la plaque dans le cas de la chromatographie ascendante:
on verse l'éluant à environ 0,5 cm du fond de la cuve. la plaque est ensuite placée en position verticale dans la cuve et l'éluant qui en recouvre le fond monte par capillarité. on place un papier absorbant et on ferme la cuve de manière à former un environnement saturant de vapeur afin d'éviter l'évaporation de l'éluant lors de son ascension le long de la plaque.
La migration: pendant la migration, la cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée. Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1cm de l'extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée à l'air libre ou à l'aide d'un séchoir.
NB: Attention dans le choix de l'éluant:
Un éluant trop polaire entraine tous les constituants de l'échantillon. Aucune séparation n'est effectuée.
Un éluant trop apolaire n'entraine pas assez les constituants de l'échantillon. les spots obtenus risquent d'être un mélange de constituants de l'échantillon.
La révélation:
Si les composants de l'échantillon sont colorés, il facile de les repèrer sur la plaque.
Si les composants de l'échantillon sont invisibles, on les rend visibles par des méthodes usuelles de révélation comme la radiation UV, la fluorescence, l'iode ou l'atomisation.
La méthode par la radiation UV est une méthode de révélation non destructive. Les composants de l'échantillon apparaissent sous forme de taches brillantes. On peut également incorporer un indicateur fluorescent à l'adsorbant. Lors de la révélation au radiation UV, la plaque entière devient fluorescente tandis que les composants de l'échantillon apparaissent sous forme de taches sombre.
La méthode par exposition de la plaque aux vapeurs d'iode est une méthode non destructive. La plaque est placée dans un atmosphère saturé en vapeur d'Iode. Les composants apparaissent sous forme de taches brunes par fixation réversible de l'Iode. La coloration est labile et disparaît après élimination des vapeurs d'Iode.
Chromatographie sur couche mince
envoyé par soschimie
La chromatographie de partage:
On la définie également comme une chromatographie liquide-liquide ou liquide gazeux.
Cette chromatographie est fondée sur la répartition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase mobile. On joue sur la notion se solubilité.
C'est une technique qualitative.
Principe de partage:
Lorsque l'on ajoute un composé dans un milieu comprenant deux phase liquides non miscibles en contact, celui-ci va se répartir dans ces deux phases dans des proportions bien définies dépendantes de son coefficient de partage K entre ces deux phases. Ce coefficient est une constante thermodynamique d’équilibre définie à une température T et à un pH donné, relative à l'équilibre suivant :
on a alors :
K=K°(T)= [concentration dans la phase 2] / [ concentration dans la phase 1]
La chromatographie de partage peut se réaliser selon 2 types de polarité de phase:
La polarité de phase normale
La polarité de phase inverse
Dans le cas de la polarité de phase normale, la phase stationnaire est hydrophile et la phase mobile (l'éluant) est hydrophobe.
Dans le cas de la polarité de phase inverse, la phase stationnaire est hydrophobe et la phase mobile (l'éluant) est hydrophyle.
NB:
La phase stationnaire peut être constituée par un film liquide imprégné sur un support rigide ou fixé (gel de silice) par liaison covalente (phases greffées). Le greffage est réalisé par silanisation créant ainsi des ponts siloxane (Si-O-Si) .
Exemple d'application:
La chromatographie sur papier unidimensionnelle en polarité de phase normale
Principe:
La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau .La phase stationnaire est constituée par l'eau elle même, absorbée par la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en chromatographie sur couche mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant qui se déplace par capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.
utilisation:
La chromatographie sur papier est employée principalement pour l'analyse de composés très polaires, tels que les acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels.
Inconvénients:
Ses plus grands inconvénients par rapport à la chromatographie sur couche mince sont :
- une durée de développement beaucoup plus longue
- une séparation généralement moins bonne.
Ps: l'utilisation de papiers spécifiques est fortement recommandé car ceux-ci possédent un faible taux d'impuretés et des caractéristiques physiques uniformes.
exemples : papier Whatman;Schleider; Shüll; Durieux; Arches.
L'électrophorèse
Histoire:
L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se sont inspirés des études de Hermann Von Helmholtz menées sur l'électro-osmose. Celui-ci constate qu'il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe opposé à leur charge.En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'électrophorèse libre. Cette technique lui a permis de séparer les protéines du serum sanguin en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée afin de réaliser des mesures optiques au travers du tube.
Il a pu ainsi obtenir sur le pôle + des protéines de charge très négative comme l'abumine et sur le pôle - des protéines de charge plus positive comme les globulines.
Cette technique ne permet toutefois pas de séparer totalement les protéines. Il est néanmoins possible de mettre en évidence les frontières formées par des méthodes optiques comme la fluorescence, l'absorption des UV ou l'indice de réfraction.
En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant la technique d'électrophorèse sur papier.
En 1952, Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode connue sous le nom d'analyse immuno-électrophorétique, qui permet d'analyser de manière précise des mélanges très complexes d'antigènes. Dès la première application de cette méthode à l'analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30 constituants indépendants, alors que l'électrophorèse en veine liquide ou sur papier ne permettait d'isoler que 5 ou 6 groupes de protéines. La méthode est rapidement utilisée dans de nombreux laboratoires médicaux pour des besoins de diagnostiques.
En 1955, O. Smithies met au point la technique d'électrophorèse en gel d'amidon.
En 1957, Joachim Kohn sépare les différents phénotypes de l'hémoglobines en élaborant la technique d'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose.
En 1969, Beber et Osborn introduisent l'agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les différentes sous-unités protéiques.
Principe:
L'électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode respective: les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (potentiel positif) et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (potentiel négatif). En ce qui concerne les molécules non chargées, il n'existe pas de migration. Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l'électrophorèse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la matrice par ces ions différent. Cela permet ainsi de les séparer.Avantages:
L'électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps.
La séparation est fine.
On peut déterminer 2 types d'électrophorèses:
L'électrophorèse dite "libre" en veine liquide (mise au point par Tisélius en 1937).
L'électrophorèse de zone sur support.
L'électrophorèse en veine liquide.
La migration dans ce type d'électrophorèse s'effectue au sein d'un liquide de composition déterminée soumis à un champ électrique de courant continu (cf. Histoire).Avantage:
Permet une bonne détermination des mobilités électrophorétiques.
Inconvénients:
Appareillage couteux.
La mise en oeuvre et longue et délicate.
Les particules ne se séparent pas complètement mais il se forme des frontières mise en évidence par des méthodes optiques telles que l'absoption ultra-violette pour les protéines.
L'électrophorèse de zone.
Ce type d'électrophorèse utilise un support poreux pour stabiliser la phase liquide. Le support doit être homogène, poreux et inerte. Différents types de support peuvent être utilisés:Support en papier ou acétate (la migration des mélanges s'effectue à la surface de celui-ci).
Support en polyacrylamide ou agarose (la migration des mélanges s'effectue à l'intérieur même du support).
Avantages:
Les fractions séparées migrent comme des "zones" individuelles.
La taille des mailles ("pores") pour les supports en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentir le déplacement des grosses molécules).
2 types de montage peuvent être mis en place:
Montage horizontal:
Utilisé pour les supports en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme de longue et étroite bande.
Les extrémités du support plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa surface.
Montage vertical:
Utilisé pour les supports en gel polyacrylamide ou, plus rarement d'agarose . Le gel est souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Durant la gélification on aura pris soin de faire des puits où on déposera les échantillons. Chaque extrémité du gel est mis en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui permettra la propagation d'un courant dans le gel.
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):
Cette technique est très utilisée en immunologie et dans l'étude des protéines car elle permet, après la séparation des différentes protéines, leur transfert sur une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène afin d'être identifier par le biais d'anticorps spécifiques.
Cette technique est également utilisée pour le séquençage de l'ADN (les méthodes traditionnelles de Maxam et Gilbert ou de Sanger permettent de séquencer à la paire de bases près).
La matrice de cette électrophorèse:
Le gel de polyacrylamide est constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant. En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient différents maillages et donc différentes densités de gel.
La polymérisation est réalisée grace à l'ajout de 2 réactifs: le TEMED (N,N,N',N' tetra-méthyl-èthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent des anions hyperactifs en présence de lumière.
La densité typique d'un gel de séparation peut être à 6%; 8%; 10%; 12% ou 15%.
Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des protéines.
Des niveaux de densité plus faibles du gel permettent de séparer des protéines de poids moléculaires proches.
La densité d'un gel de concentration (stacking gel) est à 5%. Ce gel est coulé en haut du gel de séparation. Il permet à l'échantillon une entrée homogène dans le gel de séparation. On utilise un "peigne" afin de créer des "puits" individuels pouvant accueillir chaque échantillon.
Le SDS-PAGE:
Une variante de cette technique consiste à utiliser du SDS (Sodium Dodécylsulfate) qui est un détergent anionique fort. Il a la propriété de défaire la structure spatiale en se fixant sur les protéines et de les charger de la même façon permettant ainsi de les séparer uniquement en fonction de leur masse moléculaire.
Les protéines sont dites dénaturées: elles ont perdu leur structure tridimentionnelle native.
Avant de procéder à la dénaturation des protéines avec du SDS, on utilise un agent réducteur, le b mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des proteines les rendant ainsi sous forme monomérique.
préparation des échantillons:
Les échantillons vont être traités dans du tampon de dénaturation . Celui-ci sera préparé au dernier moment.
tampon de dénaturation se compose:
de tampon Tris Hcl 0,125 mL pH 6,8
d'eau distillée;
de SDS à 4%
de b mercaptoéthanol à 10%;
de bleu de bromophénol à 0,2%
de glycérol pur
50 microlitres d'échantillons sont mélangés avec 50 microlitres de tampon dénaturant.
L'ensemble est ensuite chauffé pendant 4 minutes afin de favoriser la dénaturation des protéines.
Le matériel d'électrophorèse se compose:
des plaques
des pinces
le joint d'étanchéité
Le peigne
les espaceurs
On nettoie les plaques avant utilisation à l'aide d'eau (éventuellement savonneuse) puis avec de l'alcool à 70%. On essuie les plaques avec un papier, sans laisser les fibres sur les faces où sera coulé le gel.
On pose le joint d'étanchéité sur la plaque à bords rond.
Puis, mise en place des espaceurs et de la deuxième plaque en verre. L'ensemble est ensuite consolidé à l'aide des pinces.
Préparation de 30 ml de gel de séparation:
7,50 mL d'acrylamide bis acrylamide
11,25 mL de tampon Tris/Hcl pH8,8
0,30 mL de SDS à 10%
10,95 mL d'eau
pour la polymérisation on ajoute
30 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
300 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%
La préparation est aussitôt coulée entre les 2 plaques à l'aide d'une pipette. Afin d'éviter la présence de bulle dans le gel, on incline le montage lors du remplissage. Le gel est ensuite recouvert d'eau distillée afin d'obtenir une surface parfaitement horizontale.
Préparation de 10 ml de gel de concentration:
1,25 mL d'acrylamide bis acrylamide
1,25 mL de tampon Tris/Hcl pH6,8
0,10 mL de SDS à 10%
7,4 mL d'eau
pour la polymérisation on ajoute
40 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
100 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%
Retirer l'eau distillée au dessus du gel de séparation puis remplir le montage comme précèdemment jusqu'au niveau supérieur des plaques de verre. Le peigne est alors mis en place pour former des puits dans le gel de concentration.
Préparation d'un litre de tampon de migration:
12,5 mL de Tris 25mM
14,4 g de glycine
977,5 mL d'eau distillée
10 mL SDS 10%
Le peigne est retiré puis les plaques et les cuves de migration sont placées sur le support . Les cuves sont remplies avec le tampon de migration en commençant par la partie supérieure puis inférieure. Dépot de 50 microlitres d'échantillon protéique dénaturé dans chaque puit à l'aide d'une seringue et selon la technique sous-marine.
Les électrodes de la cuve sont reliées au générateur. La migration se fait à 30 mA jusqu'à ce que le bleu de bromophénol atteigne le bord inférieur des plaques.
Révélation:
Le gel est retiré des plaques puis placé sur un agitateur et coloré pendant 30 minutes dans une solution de coloration composée de bleu de coomassie à 2,5%,d'isopropanol à 20%, d'acide acétique à 20% et d'eau à 57,5% puis décoloré pendant 3 fois 30 minutes avec une solution décolorante composée de 45% d'isopropanol, de 10% d'acide acétique et de 45% d'eau.
La technique ELISA
Avantages de la technique:
- L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.
- Possibilité de quantifier grâce à la réalisation d'une gamme en parallèle.
- L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible.
- technique accessible à tous les biologistes.
- La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage spécialisé.
- La validité des trousses est d'environ 1 an.
- La limite de détection est moins bonne que la technique RIA.
- La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température, du pH et de l'éclairement.
il se réalise en 4 étapes:
Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les plaques sont incubées à 4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage.
La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de lavage.
La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de détection:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent spécifiquement sur les anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grace à l'apparition d'une coloration.
La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:
On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la présence de l'anticorps à doser. L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps recherché.
Exemple d'application:
Identification dans le sérum du patient, les anticorps anti-protéines de l'enveloppe et du corps du virus de l'immunodéficience humaine.
Le DAS ELISA direct ou Double Antibody Sandwich ELISA direct:
Dans ce cas de figure, l'antigène se trouve entre 2 anticorps spécifiques. L'utilisation de la DAS ELISA nécessite de posséder 2 anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents sur l'antigène.
La première étape consiste à fixer sur le support, l'anticorps de capture. On incube la solution à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.
Lors de la deuxième étape, on dépose l'échantillon possédant l'antigène à identifier qu'on laisse incuber à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.
Dans une troisième étape, on fixe l'anticorps de détection marqué avec une enzyme sur l'antigène recherché. Pour cela, on dépose la solution d'anticorps dans les puits puis on incube l'ensemble à 37°C pendant 2 heures.
La dernière étape, on dépose une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme et on laisse incuber pendant 30 à 120 minutes. Le produit de réaction obtenu est soluble et coloré. L'intensité de cette coloration peut être mesurée à l'aide d'un photomètre.
NB: la différence entre le DAS ELISA direct et le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine réside au niveau de l'anticorps de détection. Pour le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine, l'anticorps de détection porte une molécule de biotine qui interragie avec la streptavidine couplé à une enzyme.
