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biotechnologie

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Microscope optique

14 Janvier 2020 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

INTRODUCTION:

Nous ne pouvons pas distinguer deux objets (ou points) qui se situent plus près que 0,1 mm.

La taille moyenne d’une cellule est 20 μm, inaccessible à l’œil nu.

les premiers microscopes furent donc optiques ou photoniques, avant de mettre à profit d’autres rayonnements ou effets physiques.

Objectif du microscope:

  • donner une image grossie d’un petit objet (grossissement)
  • sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)
  • rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

HISTOIRE:

1632: Invention du microscope optique:

Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723), naturaliste Hollandais et marchand d’étoffes, connu comme étant le père du microscope optique.-Il développa la conception du microscope.

l fabriqua ses propres microscopes, constitués chacun d’une petite plaque de métal portant une lentille simple extrêmement convexe qui permettait d’observer l’objet monté sur une pointe très fine.

En 1680 Anton Van Leeuwenhoecka fait les premières observations en microscopie optique avec un grossissement de 300 fois environ.-Il publie ses lettres et ses dessins de bactéries, protozoaires, spermatozoïdes, globules rouges et autres dans la revue Philosophical Transactions of Royal Society.

PRESENTATION TECHNIQUE:

Le microscope  optique utilise la lumière. Il est doté de deux lentilles.

  • l'objectif, pour agrandir l'objet que l'on souhaite observer (il existe plusieurs grossissements) ;
  • l'oculaire pour que les rayons arrivent à l’œil de manière parallèle, ce qui permet à l’œil de se reposer.

Des instruments supplémentaires permettent de régler la quantité de lumière (le diaphragme) ou la mise au point (molettes liées à un système de crémaillère) pour affiner l'observation de l'échantillon placé sur la platine porte-échantillon.

La résolution des microscopes optiques ne peut être supérieure à 0,2 micromètre, cette résolution étant limitée par la diffraction de la lumière. Des techniques permettent de s'approcher de cette limite : l'utilisation d'un objectif à immersion (dans l'huile), ou en diminuant la longueur d'onde de la lumière (toutefois limitée au visible).

Sur quel principe optique, le microscope fonctionne-t-il? :

OBJECTIF:

l'objectif du microscope  est formé d’une lentille convergente de courte focale (quelques mm). Un objet placé à proximité de son foyer donne une image intermédiaire agrandie et renversée. Le grandissement de l’objectif est noté G1. Un dispositif de rotation permet de changer l’objectif.

L’OCULAIRE.

C’est une lentille convergente de plus grande focale (quelques cm). Il sert de loupe en grossissant l’image intermédiaire donnée par l’objectif.Le grossissement de l’objectif est noté G2.

Le grossissement commercial d’un oculaire est généralement compris entre 5 et 25. C’est l’indication mentionnée sur l’oculaire.

Comment calcule-t-on le grossissement du microscope?

grossissement du microscope = grossissement objectif x grossissement oculaire

Agrandir ne suffit pas!!!

Le microscope doit être capable de séparer des détails très voisins c'est le pouvoir de résolution

Pouvoir de résolution=0,61λ/n sin α

  • n= caractérise un milieu translucide
  • α= demi angle du cône de vision de l’objet par l’objectif du microscope.
  • λ = longueur d’onde

Or n=c/v donc dépend de la vitesse de la lumière dans le vide et de la vitesse de la lumière dans le milieu.


Mise au point::

La mise au point consiste en un réglage permettant d’observer l’image de l’objet au travers du microscope sans que l’œil ait à accommoder (c’est-à-dire que l’image au travers du microscope se forme à l’infini).

C’est l’ensemble du tube que l’on déplace par rapport à l’objet :Les lentilles objectifs et oculaires sont fixes l’une par rapport à l’autre La distance qui les sépare est donc constante.

Le condensateur:

Situé entre la préparation et le dispositif d’éclairage, le condenseur est un système optique qui contrôle le cône lumineux envoyé sur la préparation; la qualité de l’image dépend de son réglage méticuleux.

La lumière issue du condenseur converge vers la préparation; lors de son passage à travers la préparation la lumière devient divergente et forme un cône inversé (par rapport au cône convergent envoyé par le condenseur) qui est capté par la lentille frontale de l’objectif.

Comment utilise-t’on le microscope optique ? :

Installation du microscope:

Placez le microscope la poignée (ou statif) devant vous.

- Branchez la prise du microscope et allumez la lumière.

- Utilisez toujours en premier l’objectif le plus faible.

- Mettez un maximum d’éclairage en ouvrant complètement le diaphragme.

ATTENTION A NE PAS METTRE LES DOIGTS SUR L’OCULAIRE,LES OBJECTIFS OU EN PLEIN MILIEU DE LA PREPARATION QUE VOUS ALLEZ OBSERVER :ILS DOIVENT RESTER PROPRES POUR BIEN VOIR.

Disposition de la préparation et mise au point:

- Placez la préparation (ou lame) sur la platine du microscope,la lamelle dirigée vers le haut.Fixez la lame avec les pinces.

- Centrez la lame sur la région à observer.

- La mise au point se fait en deux étapes :

* regardez d’abord sur le côté du microscope et rapprochez au maximum l’objectif de la préparation avec la vis macrométrique (=la grosse vis).

ATTENTION POUR CETTE ETAPE, IL EST TRES IMPORTANT DE REGARDER SUR LE COTE ET PAS DANS L’OCULAIRE POUR EVITER QUE L’OBJECTIF CASSE LA PREPARATION EN VERRE (SURTOUT AU GROSSISSEMENT LE PLUS IMPORTANT).

* Puis regardez dans l’oculaire et éloignez lentement l’objectif de la préparation avec la vis macrométrique, jusqu’à voir quelque chose.

- Pour finir le réglage, vous pouvez améliorer l’image en tournant la vis micrométrique (=petite vis) et en réglant l’intensité de la lumière avec le diaphragme.

- Explorez la préparation pour trouver la zone la plus favorable.

- Passez à un objectif plus fort et ajustez la mise au point si nécessaire.

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Décantation et Centrifugation

8 Janvier 2020 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

1. La décantation

Dans un mélange hétérogène, certains constituants peuvent être visible à l'œil nu. Considérons un mélange hétérogène solide-liquide comme une eau de rivière.

Dans ce type de mélange, les particules solides « nagent » en suspension dans le liquide. Si ce mélange reste au repos quelques heures, la gravité fait son travail et entraîne les particules lourdes au fond du récipient contenant le mélange. Les particules les plus légères restent en surface. Nous appelons cette technique de séparation  la décantation. C'est la première étape du nettoyage de l'eau dans les stations de captage placées au bord des rivières.

2. La centrifugation

La centrifugation constitue un procédé de décantation perfectionnée qui permet de gagner du temps, notamment dans les laboratoires d'analyse. En effet, il faut attendre quelques minutes, voire quelques heures pour que les particules les plus denses tombent au fond du récipient.

Dans les laboratoires, la centrifugeuse est un appareil qui reçoit des tubes à essais. Les tubes sont placés à l'intérieur. Une fois mise en route, la centrifugeuse tourne à des milliers de tours/minutes. Les particules solides présentes dans les mélanges sont alors plaquées au fond des tubes à essais. En haut du tube, un liquide clair apparaît.

PRINCIPES DE BASE

Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer dans ce champ jusqu'à ce qu'elle rencontre une résistance capable de l'arrêter complètement. Ce principe fondamental de physique est très utilisé en biochimie pour séparer des précipités, des cellules, des organites et même des macromolécules. En mettant une préparation biochimique dans le rotor d'une centrifugeuse et en faisant tourner celui-ci, on génère une accélération qui va pousser les particules qui la composent vers l'extérieur du rotor, c'est-à-dire le fond du tube à centrifuger. La vitesse avec laquelle se déplaceront ces particules est proportionnelle à

- la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise

- la masse de la particule

- la différence entre la densité de la particule et celle du solvant,

et inversement proportionnelle à

- la friction avec le milieu, en fonction de la taille et à la géométrie des particules.

Une particule donnée (e.g. une sous-unité d'un ribosome) a donc une vitesse spécifique de sédimentation lors d'une centrifugation parce qu'elle a une combinaison donnée de masse, de densité et de morphologie. On exprime souvent cette caractéristique en coefficient de sédimentation, généralement exprimée en unités Svedberg (S). Plus une particule est massive ou dense ou ne génère qu'une faible friction (due à sa forme), plus son S sera élevé. Cette unité de "taille" est particulièrement employée pour caractériser les particules ribosomiques. C'est pourquoi on parle encore de ribosomes 70 S chez les procaryotes et 90 S chez les eucaryotes.

On peut facilement générer une force centrifuge ( résistance au changement de direction imposé par une force centripète. C'est une résistance par inertie et non une force active) en faisant tourner à haute vitesse un rotor pouvant contenir des tubes à centrifuger. Une force gravitationnelle se forme alors perpendiculairement à l'axe de rotation du rotor.

Au cours de la centrifugation, les composés dans le fluide situés à une distance r de l'axe de rotation sont soumis à différentes forces:

  • La force de pesanteur descendante Fp
  • La  poussée d'Archimède ascendante Fa
  • Une force de friction  Fv
  • La  force centripète F'c
  • La force centrifuge Fc

Cette force centrifuge, exprimée en newtons, est donnée par la relation

Fc = mγc

avec γc = rω² en m/s²

dont :

  • La masse m du composé à séparer
  • La distance r du tube à l'axe de rotation de la centrifugeuse
  • La vitesse angulaire ω exprimée en radians par seconde ou en tour par minute.

la centrifugation  permet de séparer :

  • deux phases liquides ;

  • une phase solide en suspension dans une phase liquide ;

  • deux phases liquides contenant une troisième phase solide.

Il existe deux catégories principales de centrifugeuses :

  • les centrifugeuses à axe vertical, appelées communément clarificateurs ou séparateurs centrifuges (avec un bol à assiettes ou à chambres qui tourne sur un axe vertical) ;

     

  • les centrifugeuses à axe horizontal, appelées communément décanteurs centrifuges (avec un bol cylindroconique qui tourne sur un axe horizontal et une vis disposée à l’intérieur du bol permettant l’évacuation des sédiments).

 

L’ultracentrifugation est une méthode de centrifugation dont le but est de séparer  des particules très fines dispersées dans un liquide de densité pratiquement égale. Pour que cette séparation ait lieu la vitesse de rotation de la centrifugeuse doit dépasser les 15 000 tours par minute.

La centrifugeuse utilisée est appelée ultracentrifugeuse . Le rotor de cet appareil se déplace dans un vide, de sorte qu'aucune résistance de l'air ne se produise.

L’ultracentrifugation a été développée au milieu des années 1923 par Theodor Svedberg ( Il montra son utilité pour la séparation de protéines, ce qui lui valut la Médaille Franklin  en 1949. Il obtint le prix Nobel de chimie en 1926) . L’ultracentrifugation peut être utilisée pour des fins analytiques ou préparatives.

 

 

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Bactériophage et phagothérapie

16 Octobre 2017 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Définition:

Un bactériophage est un virus n'infectant que des bactéries.

En grec, phageton signifie nourriture/consommation.

Très utilisés dans la recherche en génétique moléculaire.

Les bactériophages sont présents dans l'ensemble de la biosphère. Ils sont présents en quantité plus importante dans les excréments, le sol et les eaux d'égout.

Histoire:

La découverte de l'activité des bactériophages se fait en 1915 par Frederick W. Twort (à Londres) qui remarque que des colonies de microcoques (virus de la vaccine (sorte de variole)) prennent parfois un aspect vitreux, en 24 h à 37 °C dû à une destruction des cellules bactériennes, et que cette caractéristique est transmissible à des colonies normales par simple contact.

En 1917, Félix d'Hérelle fait la même observation dans des selles de malades atteints de dysenterie bacillaire (maladie du côlon), isole les premiers phages, et développe les premières applications thérapeutiques. Le support de l'information génétique (génome) des bactériophages peut être un ADN ou un ARN. Si Twort a découvert les bactériophages, c'est d'Hérelle qui a découvert la phagothérapie.

 

Dans les années 1940-1960, les travaux effectués sur les bactériophages ont permis de faire de nombreuses avancées dans le domaine de la biologie moléculaire (avancées portées par Max Delbrück, dans le cadre du "groupe phage") et ont notamment permis de découvrir que les acides nucléiques constituaient le support de l'information génétique (expérience de Hershey-Chase en 1952).

morphologie et structure du bactériophage:

Le virion ne procède qu'un seul type d'acide nucléique : soit de l' ARN., soit de l' ADN.
1)    Le virion se produit à partir de son seul acide nucléique alors que les autres êtres se reproduisent à partir de la somme de leurs constituants.
2)    Le virion est incapable de croître et de subir des divisions binaires.
3)    Le virion n'a aucune information génétique concernant les enzymes du métabolisme intermédiaire (susceptibles de produire de l'énergie).
4)    La multiplication des virions implique l'utilisation des structures de la cellule hôte, et spécialement de ses ribosomes.


Classification des bactériophages:
Quatre critères essentiels sont retenus:
-    La nature des matériels génétiques (ADN ou ARN) ;
-    le type de symétrie suivant lequel le virus est construit (hélicoïdale, icosaèdrale, combiné) ;
-    le caractère nu ou enveloppé de la nucléo capside.
-    les données quantitatives concernant le virion a symétrie icosaèdrale, longueur et épaisseur des nucléo capside pour les virus a symétrie hélicoïdale.

Il y 4 types particulièrement étudiés. La plupart infectent E. coli.

Phage de la série T:

T2:

Ces phages sont à l'origine de beaucoup de manipulations de Biologie moléculaire, les T2 en particulier. (début du 20ème siècle:) A partir de l'étude du T2, HERSHEY et CHASE ont pu mettre en évidence que l'ADN était le support de l'information génétique. D'autre part, VOKIN et ASTRACHAN ont mis en évidence le rôle de l'ARNm et sa fonction biologique.

T7:

Les T7 sont utilisés pour des vecteurs de clonage comme promoteur fort.

Les T pairs comme les T2,4,6 appartiennent à la famille des Myoviridae. A la place de la Cytosine il y a de l'HydroxyMéthylCytosine dans leur génome. L'intérêt est que cela leur permet de résister aux enzymes de restriction lors de l'infection.

Les T impairs appartiennent à la famille des Podoviridae.

Tous les phages de la série T possèdent un ADN linéaire bicaténaire et possèdent une structure avec « tête et queue ».

Phage Tempéré:

Ils présentent deux cycles de multiplication, contrairement aux phages T.
-> un cycle lytique, comme les phage T,
-> un cycle lysogène: le phage s'intègre dans le génome bactérien au lieu de rester virion.
Le plus étudié est le phage "lambda" notamment pour les clonage.
Autres: phage P1, P22, P5 et phage Mu.

Petit phage à ADN:

Ce sont des phages de petite taille avec deux sortes de nucléocapside.
-> nucléocapside icosaédrique (comme X174, S13). L'étude de ces phages a été à l'origine de la découverte des gènes superposés.
-> nucléocapside filamenteuse (comme phage fd, phage M13). Ces phages sont très utilisés car ADN simple brin (donc facilement séquençable).

Phage à ARN:

Ils appartiennent à la famille des Leviridae comme le phage Qß, Ms2. Ils servent de modèles pour la traduction de l'ARN.

Les phages présentent différents types de génomes: ADN double-brins, ADN simple-brin, ARN; et différents types de structures de nucléocapside: filamenteuse, isocaïdrique ou comme les T2.

Structure des phages:

Depuis les surprenantes images de bactériophages "en forme de têtards" observées au microscope électronique par les premiers expérimentateurs (Ruska, en 1941, Lurai Delburck et Anderson en 1941), le développement considérable des recherches sur la structure des bactériophages a conduit à la description de nombreuses variétés morphologiques et à l'élaboration d'une véritable anatomie ultrastructurale de ces virus.
Actuellement en peut réunir les bactériophages en trois grands groupes morphologiques :
-    cubique.
-    Filamenteux.
-    Mixte.

Le phage lambda (λ ) est un virus à structure mixte. Le diamètre de la tête et de 100 mm. Les virions sont constitués par 12 protéines structurales localisées dans l'enveloppe (P9, P10 et P13), Peplomers (P3 et P6), nucléocapside (P8 et P5), complexe polymérase (P1, P2, P4 et 97) et une protéine non structurale P12. Les protéines constituent environ 70% du poids de la particule.

Deux Types de Cycles.

Infection lytique:

Ici le phage se multiplie au dépend de la bactérie et généralement la détruit. Ces sortes de phages sont dits « virulents ».

Infection lysogène:

Ici le génome du phage est injecté dans la bactérie, mais ne s'y réplique pas. Par contre il va s'intégrer dans le génome bactérien. La multiplication du phage se fait grâce à la réplication du chromosome bactérien. Le phage s'intègre à un seul endroit du génome bactérien.
Quand le phage est intégré, il y a un phénomène d'immunité qui préserve la bactérie d'une surinfection du même phage.
Un phage intégrer = prophage et seuls les phages tempérés ont la capacité d'avoir un cyle lysogène (ils possèdent aussi un cycle lytique).

Cycle lytique du phage T2.

Phase d'absorption:

Le phage se fixe sur la bactérie. C'est une phase fondamentale car il y a une reconnaissance spécifique entre le récepteur et le phage (sinon pas de fixation). Les conditions d'absorption dépendent, parfois des cofacteurs libérés par la bactérie qui va être parasitée.
Ex: T4 se fixe bien si la bactérie libère Tyr.
"lambda" se fixe bien si la bactérie libère Mg2+.
Le récepteur, au niveau de la bactérie, varie suivant le phage.
T2 = porine; "lambda" = porine lam B.
On retrouve ainsi des pilus sexuels (F) pour M13. Certains utilisent le LPS comme site de fixation.

Phase de fixation:

Pour le phage T2, la fixation est effectuée par les filament codaux et la plaque terminale. Elles devient rapidement irréversible. C'est ici que les enzymes de la plaque codale s'activent et hydrolysent les enveloppes bactériennes pour pouvoir injecter l'ADN virale.

Injection du Génome:

Elle est réalisée par contraction de la gaine externe qui favorise la pénétration du cylindre central.

Phase d'éclipse:

Après injection, le virion cesse d'exister, ne persiste que le génome dans la bactérie. Il n'y a plus de particule virale (environ 12 min). De nombreux évenements se déroulent alors: la synthèse de l'ADN bactérien est stoppé par le phage, une DNAse phagique va dégrader le génome bactérien (DNAse phagique pendant 2 à 3 min après l'injection , issue des gènes précoces). Il y a aussi production d'ARNm et production de protéines constituant la nucléocapside et, parallèlement l'ADN se mulitiplie. Cet ADN est formé sous forme de "concatemères" (= cercle roulant) c'est-à dire plusieurs séquences d'ADN collées à la suite. Ici accumulation des différents composants du phage: ADN phagique, nucléocapside => finde la phase d'éclipse.

Phase de maturation et libération:

Entre 12 à 15 min. L'ADN produit en concatemère est coupé en fragments de taille normale avec parfois des sources d'erreurs (101 à 112% taille totale du génome) donc fragments plus longs ou plus courts. Ce qui est à l'origine d'une importante mutation des phages. La nucléocapside se structure, il y a alors apparition de la particule virale = virions dans la bactérie.
Quand la bactérie accumule entre 100 à 200 virions, il y a activation d'une endolysine phagique qui entraîne l'éclatement de la bactérie et la libération des phages.

Cycle lysogène du phage "lambda" .

La strucutre est "tête et queue" mais ici le phage ne possède pas de filaments codaux. Ici, l'expression du phage est réprimée. Pour sortir de cette phase lysogène il faut que la bactérie hôte subisse "un stress" (rayons X, UV, agent mutagène,...) alors le phage devient productif -> cycle lytique.

Génome du phage "lambda" :

Il s'agit d'un phage qui infecte E. Coli K12. Il possède une génome double-brin à extrémités cohésives (donc circulaire).
Lorsque le génome du phage est infecté dans la bactérie il se circularise.
Taille » 49Kpb.

  • 1. --- Gènes impliqués dans la régulation de lysogénie.
    2. --- Gènes impliqués dans la recombinaison, c'est-à dire l'étape d'intégration (aH: séquence complémentaire qui permet l'intégration).
    3. --- Gènes impliqués dans la synthèse de m'ADN (lytique).
    4. --- Gènes impliqués dans le phénomène de lyse de la bactérie (lytique).
    Tout le reste sont des gènes qui codent pour la nucléocapside, des gènes structuraux.
Cycle lytique du phage "lambda" :

Il débute comme le phage T2.
Résistance à la bactérie = Lam B.
Quand le génome est injecté, il se circuralise et il débute sa transcription. Protéine Cro et N dès le début.
Cro = régule les cyles lysogène / lytique.
N = permet la synthèse d'ARNm de taille variable "aterminateur".
Puis CII, CIII et Q --> switch --> soit lysogène soit lytique.
Dans la phase lytique [Q] augmente ce qui entraîne l'augementation du régulateur Pro: on bloque alors les protéines qui activent la lysogénie (rétocontrôle +). Le phage produit alors des ARNm longs et donc fabrique sa tête et sa queue.
Comme le phage T2, l'ADN est répliqué sous forme de contatemère puis est réduis par une DNAse virale qui génère les extrémités cohésives (ex: EcoR1).

Cycle lysogène du phage "lambda" :

Pour qu'il soit induit il faut réprimer les gènes tardifs, qui codent pour le tête et la queue et activer les gènes de recombinaison. La protéine régulatrice est CI. Par un système de régulation génique, CI s'exprime et augmente ce qui inhibe les gènes tardifs. Il y a alors activation du cycle lysogène ou le génome viral s'intègre au génome bactérien. La sortie de cette phase lysogène (phase naturelle du phage) se fait par REC A (protéine bactérienne) qui est produit en cas de stress (RECA hydrolyse CI ce qui induit le cycle lytique).

Applications.

  • Diagnostic et Taxonomie:

Principe de la lysotypie: on s'en sert au niveau médical, au niveau industriel pour identifier les couches de levain. La recherche du phage est un indicateur de Contamination Fécale (eau, aliments,...).

Outils de la Biologie Moléculaire:
  • M12 possède un ADN monobrin donc utile pour le séquençage. ll est utilisé comme vecteur de clonage (phagemide) et comme un système de traduction in vitro (production d'ARNm).

 

  • la phagothérapie moyen pour lutter contre des infections bactériennes comme la maladie de Lyme?

La Borrelia responsable de cette maladie se soigne par antibiotiques, mais les traitements sont lourds et ne l’éliminent pas toujours. De plus, faisant partie des bactéries les plus rapides et les plus mobiles que l’on connaisse, on la sait capable de se loger dans tous les tissus du corps humain, se rendant comme invisible et, de ce fait, inatteignable par les antibiotiques. En effet, pendant toute la durée du traitement, elle peut se localiser sous forme de kyste spongieux, attirant les globules blancs qui finissent par s’agglutiner et ainsi la dissimuler. La bactérie s’en sort saine et sauve en laissant des lésions créées par l’amas de globules blancs.

En 1982, Hayes, Burgdorfer et Barbour ont enregistré et observé l'attaque d'un phage contre Borrelia burgdorferi in vivo et ont pris des photographies pour enregistrer l’événement. Les images capturées sont celles d'un bactériophage de type B3, décrit par les chercheurs comme ayant une "tête allongée de 40 à 50 nm et une queue de 50 à 70 nm de long. Il semble dépourvu de collets ou de structure en cerf-volant".

En 2001, Eggers et al ont publié leur découverte d'un phage de Borrelia burgdorferi (Bb) nommé phiBB-1 (également appelé φBB-1). Ce n'est pas le meilleur candidat pour une utilisation dans le traitement par les bactériophages, car il s'agit d'un phage lysogène tempéré.

Les phages lysogènes restent inactifs en tant que virus lorsqu'ils sont des prophages et ne se répliquent qu'avec le génome de l'hôte, à moins d'être mobilisés. En revanche, les phages virulents, ayant été répliqués et assemblés en virions complets, provoquent une lyse rapide et la mort de la cellule bactérienne, avec une libération de 10 à 100 virions par phage. Ces virions trouvent alors plus de proies et disparaissent lorsqu'elles ne peuvent plus trouver de bactéries. 

Malheureusement, à ce jour, ni les scientifiques, ni aucun centre de recherche n'ont travaillé sur le traitement des phages contre les souches de Borrelia.

 

L'un des obstacles majeur dans la recherche et la mise sur le marché de produits de phagothérapie est l'hyper spécificité des bactériophages à chaque souche de bactérie et donc peu adaptés au développement industriel, et par ailleurs difficilement brevetables.
 

Article en rapport avec ce sujet

https://www.francetvinfo.fr/sante/decouverte-scientifique/infection-bacterienne-une-jeune-fille-sauvee-grace-a-des-phages_3442843.html

 

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Les hématimètres

18 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:

  • Louis-charles Malassez, scientifique français né à Nevers 1842-1909. Malassez est connu pour l'invention de l'hémocytomètre, un outil pour mesurer quantitativement le nombre de cellules sanguines.
  • Jean Nageotte, Né à Dijon 1866-1948. Il fut médecin de la Salpêtrière et professeur au collège de France. En 1902, il fait des essais de numération du liquide céphalo-rachidien et envisage la nécessité d'employer un hématimètre pouvant contenir 100 mm3 au moins de liquide.
  • George Hayem et A Nachet en 1875 élaborent un hématimètre à platine mobile transversalement pour déplacer réguliérement la cellule et faciliter la numération des globules blancs. http://gallica.bnf.fr/ark:/12148/bpt6k6274641v/f19.image​
hématimètre de Hayem  et Nachet

hématimètre de Hayem et Nachet

Définition:

 

Les numérations globulaires de différents liquides biologiques (sang, urine, liquide céphalo rachidien) sont possibles, en dehors de tout automate, grâce à l'utilisation de "cellules" de verres calibrées appelées hématimètres. Ces lames de verre épaisses creusées de rigoles, présentent un quadrillage particulier sur la plate-forme centrale légèrement abaissée. Recouverte d’une lamelle posée sur les platesformes latérales élevées, un volume très précis et connu permet de dénombrer les cellules des liquides biologiques.

  • Les prélévements de sang sont étudiés en utilisant les cellules de Malassez, Thoma ou Neubauer.
  • Les urines, on utilisera plutôt une cellule de Lemaur.
  • Les liquides céphalorachidiens, on comptabilisera en utilisant les cellules de Nageotte.

NB: Les prélévements riches en cellules doivent être comptés après dilution.

 

 

Protocole:

 

  • Passer la culture au vortex pour dissocier les amas cellulaires.
  • Repérer à l'oeil nu le quadrillage sur le centre de la lame.
  • Recouvrir avec lamelle en humectant les plates-formes latérales de l'hématimètre. Pour faire adhérer la lamelle appuyer légérement.
  • Remplir le quadrillage par capilarité, en déposant la culture à l'aide d'une pipette pasteur ou d'une micropipette. Appliquer l'extrémité de la pipette légèrement inclinée sur la plateforme centrale prés de la lamelle. Le liquide s'étend par capilarité. Le remplissage doit être rapide et réalisé en une seule fois, sans débordement dans les rigoles et sans bulles d'air.
  • Laisser les cellules sédimenter une à deux minutes avant observation.
  • Observer au microscope, objectif 10 ou 20 pour une vue d'ensemble. Vérifier la répartition homogène (si elle est hétérogène, recommencer la mise en cellule).
  • Selon l'hématimètre utilisé et selon les élèments comptés, on sera amené à compter un carré, une bande voire la cellule entière.

NB:Quel que soit l'hématimètre et la surface à compter, on compte tous les éléments situés à l'intérieur des lignes délimitant cette surface. Pour les éléments situés sur les lignes, on applique la régle de la limite des lignes, c'est à dire que les éléments qui sont présents sur le bord supérieur et sur le bord gauche sont comptabilisées mais pas ceux situés sur le bord inférieur et sur le bord droit afin d'éviter de les compter 2 fois.

 

 

Il est possible de différencier les cellules vivantes, des cellules mortes par l'utilisation de colorant.

Définition:

Un colorant est une substance qui met en évidence une structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de celle-ci.

Condition d'utilisation:

  • Le colorant doit être utilisé à concentration faible.
  • Il faut que ce colorant s'accumule dans un élèment cellulaire.

 

Il existe 2 types de colorants:

  • Les colorants vitaux ou d'inclusion. Ces colorants colorent les cellules vivantes. Exemple: le rouge neutre (colorant cationique) qui se concentre dans les vacuoles des cellules végétales et les lysosomes.
  • Les colorants supravitaux ou d'exclusion. Ces colorants colorent les cellules mortes. Ils ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un mécanisme d'exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme necessite de l'énergie sous forme d'ATP que seules les cellules vivantes possédent.  Exemples: Le bleu Trypan, l'érythrosine B, le bleu de méthylène de Funk (Il sera réduit sous forme incolore dans les cellules en activité), les colorants fluorescents ( l'iodure de propodium; le bromure d'éthydium).

Calcul des résultats:

 

Nous prendrons comme exemple l'utilisation de la cellule de Malassez.

la dimension d'une bande est de :

  • longueur 2,5 mm
  • largeur 2 mm
  • hauteur 0,20 mm

​Soit un volume du quadrillage total de 1 μL

Cette bande est constituée de 100 rectangles d'égales surfaces dont 25 sont dévisés en 20 petits carrés pour faciliter le comptage.

Un rectangle ou unité de comptage contient 0,01 mm3 c'est à dire 0,01μL

rappel: 1 mm3 = 1 μL = 1.10-3 mL = 1. 10-6 L

Formule à appliquer:

N= n/a.v x Fd

N: nombre de cellules par unité de volume

n: nombre de cellules comptées

Fd: facteur de dilution

a: nombre d'unités de comptage dénombrées

v: volume d'une unité de comptage

 

les différents types d'hématimètres différent par le volume de l'unité de comptage ou par le nombre total d'unité de comptage. On utilisera la même formule en adaptant ces différences dans le calcul.

-----------------------------

 

Les hématimètres

La cellule de Nageotte

Le quadrillage total est constitué de 40 bandes (chaque bande a un volume de 1,25 μL).

La dimension d'une bande est de :

  • longueur 10 mm
  • largeur 0,25 mm
  • hauteur 0,5 mm

------------------------------

La cellule de Thoma

NB: La cellule de Thoma est déconseillée pour la numération des leucocytes du fait de sa faible profondeur.

Le quadrillage total:

  • Un grand carré de coté 1mm
  • Hauteur 0,1 mm​

Soit un volume du quadrillage total de 0,1 μ

La cellule de Thoma est constituée de 16 grands carrés contenant 16 petits carrés,  de 4 groupes de 3 lignes horizontale et de 4 groupes de 3 lignes verticales.

Les cotés de chaque petit carré mesurent 0,05 mm.

Le volume délimité par un petit carré est de 0,00025 μL soit pour 16 petits carrés un volume de 0,004 μL.

-------------------------------

 

Les hématimètres

La cellule de Neubauer

Les leucocytes sont comptés dans les quatre grands carrés bleus composés de 16 petits carrés (= 64).

Les érythrocytes et les thrombocytes sont comptés dans les 4 lignes rouges dans le quadrillage central

composé de 20 très petits carrés (= 80).

La hauteur entre la chambre et la lamelle est de 0,1mm.

 

Le volume est de :

- grand carré 1mm x 1mm x 0,1 mm = 0,1 mm= 0,1 μL

- très petit carré 0,05mm x 0,05mm x 0,1 mm = 0,00025 mm= 0,00025 μL

Les hématimètres
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Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

6 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Principe générale :

Les prises d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont incorporées dans un milieu de culture liquide conçu pour permettre la croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. La croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible (virage d’un indicateur de pH coloré).

 

Principe de la méthode du nombre le plus probable:

cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organismes supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire.

L’estimation de la densité  bactérienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs dilutions successives de la suspension bactérienne originelle dans des milieux de cultures liquides. Il s’agit d’une méthode quantique et non pas énumératif.

 

Protocole expérimental d'une dilution successive de facteur 10:

Matériel:

  •  5 tubes contenant 9 mL de diluant (eau distillée en général sauf indication contraire: eau physiologique, eau peptonée, tryptone-sel, ...).
  • 5 pipettes stériles en plastique de 1mL
  • 1 vortex (facultatif)

Réalisation de la dilution  de facteur 10:

  • Homogéneiser la suspension microbienne à prélever (agitation par mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à l'aide d'un vortex).
  • Ouvrir et flamber l'ouverture du tube.
  • Prélever 1mL de suspension à l'aide de la pipette plastique stérile (ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1cm).
  • Flamber et refermer le tube.
  • Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, flamber l'ouverture y introduire le volume prélevé (éviter tout contact entre la pipette contenant l'inoculum et le diluant stérile).
  • Flamber et refermer le tube.
  • Jeter la pipette souiller dans le bac à eau de javel.

La dilution suivante s'effectue comme la dilution décrite ci-dessus mais en partant du tube de la dilution précédente.

Exemple: 

La dilution 10-5 sera effectué en prenant 1mL de la dilution 10-4 préalablement  homogenéïsée qui sera introduit dans un tube contenant 9 mL de diluant.

L'utilisation de cette méthode avec un tube par dilution entraîne une forte incertitude que des methodes statistiques tentent de pallier par des essais multiples (2 ou 3 tubes par dilution).

Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

 

Observation des résultats:

 

La seule manière de savoir si un micro-organisme est présent ou non dans l'inoculum par les techniques en milieu liquide sera de le mettre en évidence par un de ses caractères:  trouble et production de en gaz en BLBVB (bouillon lactose bilie au vert brillant).

 

Si l'un de ses caractères apparait, le résultat sera positif.

L'absence de l'un de ses caractères, le résultat sera négatif.

 

exemple de resultat:

Volume de l'inoculum: 1mL  Produit pur 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultat + + + + - -

Il y a au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-3  et moins d'un micro-organisme dans 1mL  de la dilution 10-4 et donc on peut en déduire qu'il y a au moins 103 micro-organismes mais moins de 104 micro-organismes dans 1mL de produit pur.

Résultat avec des essais multiples (3 tubes par dilution):

 

Dilution produit pur 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultats +++ +++ +++ ++- +-- ---
Chiffre égal à la somme des tubes positifs 3 3 3 2 1 0

Interprétation statistique: méthode du NPP (table de Mac Grady):

 

Dans la ligne "chiffre égal à la somme des tubes positifs", choisir le nombre à 3 chiffres le plus grand possible et inférieur à 330 (meilleur répartition dans les dilutions).

Se reporter au table de Mac Grady pour 3 tubes de dilution afin de trouver le NPP correspondant au nombre 321: le NPP est 15.

Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10--2  mL. D’après les limites de confiance données par certaines tables, cette valeur numérique de 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38 avec une probabilité de 95 %, entre 2 et 52 avec une probabilité de 99 %. 

Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

En déduire la concentration en micro-organismes par mL de produit pur N.

NPP= nombre le plus probable obtenu par lecture de la table de Mac Grady

V inoculum= 1 mL

Fd= facteur de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique 10-2

 

N= NPP /V inoculum * Fd

15/0,01 =15 102  micro-organismes par mL

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Analyse des coliformes dans les eaux

4 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Les bactéries coliformes existent dans les matières fécales mais peuvent également se développer dans certains milieux naturels (sols, eau, végétation): l'absence de coliformes totaux ne signifie pas nécessairement que l'eau ne présente pas de risque pathogène. Les bactéries coliformes qui peuplent l'intestin peuvent être identifiées par leur tolérance à une température de 44-45°C. La présence de ces coliformes thermotolérants est une preuve indiscutable d'une contamination par matières fécales.

Ces bactéries coliformes sont des bactéries en bâtonnet, Gram négatifs, oxydase négatif, aérobies ou anaérobies facultatifs. Les coliformes thermotolérants sont les colibacilles et E coli.

 

La norme: 0/100mL d'eau

 

Protocole expérimental:

On procède à la filtration sur membrane de 100mL d'eau puis la membrane est mise en culture sur une gélose nutritive.

Matériel:

  • Matériel de stérilisation (four, autoclave ou autocuiseur).

  • Etuve ou enceinte thermostatée 37°C+/- 1°C.

  • Matériel de microbiologie: boites de pétri stériles, pipettes 1mL stériles (usage unique), flacons stériles.

  • Système de filtration sur membrane et membranes stériles, trompe à vide.

  • Gélose au Tergitol 7.

 

Travail préparatoire:

  • Préparation de la gélose et conservation.

Suivre les indications fournies avec la gélose au Tergitol 7, stériliser en flacons de 100 mL à 200 mL.

 

  • En zone stérile

Couler la gélose dans les boites de pétri petit diamètre. Laisser refroidir couvercle en partie ouvert. Quand la gélose est solide, fermer la boite et placer au réfrigérateur, gélose vers le haut.

 

  • Stérilisation des flacons de prélèvement

Mettre du coton cardé (hydrophobe) sur l'embouchure, recouvrir de papier aluminium. Stériliser au four à 170°C pendant 1 heure ; à l'autoclave à 120°C pendant 20 min ; dans une cocotte minute contenant un peu d'eau pendant 40 minutes après la mise en rotation de la soupape.

 

  • Stériliser le système de filtration, ou seulement la partie supérieure qui recueille l'échantillon d'eau. Entourer la partie à stériliser de papier aluminium. Après stérilisation, conserver dans le papier aluminium.

 

Prélèvement:

  • Eau de rivière, de puits, etc.

Attacher la bouteille stérile à une corde, lester. Maintenir la bouteille dans l'eau à la profondeur souhaitée. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium.

 

  • Eau du robinet.

Nettoyer le robinet avec un tissu propre, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min. Stériliser à la flamme (briquet, lampe alcool) l'embouchure du robinet, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min.
Remplir le flacon en laissant un peu d'air. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium. Conserver l'échantillon au réfrigérateur, ensemencer le plus vite possible.

 

Filtration sur membrane:

  • Préparer une zone stérile : placer autour du bec Bunsen les boites de pétri avec gélose au Tergitol 7 et les pipettes stériles.
  • Placer la membrane stérile sur le système de filtration.
  • Mettre en place la trompe à vide.
  • Agiter le flacon vigoureusement.
  • Verser 100 mL d'échantillon d'eau et filtrer en aspirant avec une trompe à vide.

 

Ensemencement:

  • Mise en culture en zone stérile.
    Ouvrir le système de filtration et retirer la membrane avec une pince stérile.
    Déposer la membrane sur la gélose, face contaminée en haut. Les éléments nutritifs de la gélose traversent la membrane, ce qui permet le développement des bactéries en surface.

 

Incubation:

  • Placer les boites à l'étuve à 37°C (incuber les boîtes couvercle vers le bas pour que la condensation s'accumule dans le couvercle) .
    Pour la recherche de coliformes, placer les boîtes à 37°C pendant 24 et 48 heures.
    Pour la recherche de coliformes thermotolérants, placer les boîtes à 44°C pendant 24 et 48 heures.

 

Résultats:

  • Identification des colonies et dénombrement

Le dénombrement des bactéries repose sur le principe selon lequel une colonie se forme par divisions d'un seul micro-organisme.
Examiner la membrane à la fin de l'incubation, à travers le couvercle.
Pour des raisons de sécurité, ne jamais ouvrir la boîte.
Coliformes : sont considérées comme caractéristiques les colonies qui présentent une coloration jaune orangé.
Coliformes thermotolérants : sont considérées comme caractéristiques les mêmes colonies que pour les coliformes, mais après incubation à 44°C.
Compter les colonies en marquant chaque colonie sur le fond de la boîte avec un marqueur indélébile.

Lisibilité:

  • Est considérée comme lisible une membrane où sont présentes au plus 100 bactéries. Si le nombre est supérieur, il faut procéder à des dilutions.

 

Calcul:

  • Exprimer le résultat en nombre de bactéries par 100 mL. Tenir compte de la dilution éventuelle.

 

Décontamination:

  • Ouvrir les boîtes au laboratoire, les décontaminer à l'autoclave à 120°C pendant 20 minutes ou dans l'eau de Javel diluée (un berlingot de 250 mL complété à 1 L avec de l'eau distillée) pendant 24 heures.
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Biomatériaux

21 Octobre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Définition:

Tout matériau, naturel ou non, comprenant tout ou partie d'une structure vivante ou d'un appareil biomédical qui exécute ou remplace une fonction naturelle.

Histoire:

  • Van Meek’ren (1668): xénogreffe de voûte crânienne à partir d’un crâne de chien
  • Autogreffe en 1810 par Van Merren
  • Allogreffe: problème de conservation (Ollier 1867)

Les matériaux naturels:

  • Une AUTOGREFFE : greffe des propres tissus d’un individu à lui-même.

Les sites de prélèvement sont l'os iliaque, le ramus, la zone rétromolaire et l'os pariétal.

La résorption du greffon peut être faible à importante, voire totale : l'origine embryologique et le mode d’ossification du site de prélèvement sont prépondérants.

Le taux de réussite de ce type de greffe est maximal, étant donné que le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) du donneur et du receveur est le même. Aucune réaction immunitaire n'est déclenchée.

 

  • Une XENOGREFFE : greffe des tissus d’un individu à un autre d’une autre espèce.

Le porc est l'un des meilleurs animaux donneurs d'organes pour l'humain, en raison notamment de sa disponibilité et de la taille de ses organes mais nous pouvons également utiliser comme donneurs le corail, la seiche et les mammifères (cheval, vache, cochon, mouton).

Leur indication réside dans les zones soumises à des contraintes (propriétés mécaniques intéressantes), mais non utilisables pour les grandes pertes de substance.

Le risque de transmission (virus, prions) est faible, mais non nul. Les traitements consistent en l’élimination des débris cellulaires, la déproténéisation, la délipidation, l’inactivation des virus et des prions, une stérilisation par irradiation.

Cette technique est encore expérimentale pour les organes et les cellules. Elle est appelée à se développer en raison de la pénurie d'organes humains pour les allogreffes. Elles est en concurrence avec d'autres voies de recherche qui sont la substitution mécanique des organes déffaillants («coeur artificiel») et les cellules souches.

 

Dans les xénogreffes, nous pouvons cité les exemples suivants:

 l'hydroxyapatite biologique:

Ce sont des xénogreffes céramisées à très haute température et transformées en hydroxyapatites biologiques, minéral constitutif de l’os.

Exemple d'application:

L'hydroxyapatite biologique (HA) a été obtenue à partir d'arêtes de poissons, disponibles en tant que coproduits de la pêche. Des arêtes d'espadon et de thon ont été nettoyées et soumises à un traitement thermique. Le matériau obtenu à 600°C est une HA des type B et à 950°C un matériau biphasique (HA biologique/ß-TCP ratio 87/13). Des tests in vitro ont montré que les matériaux obtenus ne sont pas cytotoxiques.Ces biomatériaux peuvent servir d'implants en chirurgie osseuse et dentaire, et   contrairement à l'apatite synthétique ils renferment du magnésium et du strontium, ce qui est bénéfique pour les applications médicales.

 

les carbonates de calcium:

Origines : corail, nacre, seiche.

1976: Patat et Guillemin

Le corail naturel est purifié (élimination de la matrice organique) et stérilisé (rayons ionisants β). Ce matériau correspond à un carbonate de calcium, de formule CaCO3, cristallisé sous forme d’aragonite. Différentes espèces sont utilisées selon leurs caractéristiques structurales et les indications cliniques : le corail Porites lutea est préconisé en Odontologie.

D’une porosité de 100 à 200 microns, similaire à celles de l’os spongieux, le carbonate de calcium est biocompatible et résorbable.

La cinétique de résorption dépend de l’espèce, du site d’implantation, du volume, de la taille et du volume des pores. Le processus est lié à l’action des cellules et des ostéoclastes, ainsi qu’à l’action des fluides interstitiels (dissolution de surface).

Son rôle mécanique de soutien lui confére des utilisations multiples (fractures, rachis …). On note un problème de tolérance locale si non-céramisé.

 

  • Une ALLOGREFFE : greffe des tissus d’un individu à un autre d’une même espèce.

Etant deux individus distincts, donneur et receveur possèdent des complexes majeurs d'histocompatibilité (CMH) différents. Dans ces cas, la greffe s'accompagne d'un traitement immunosuppresseur visant à prévenir une des complications majeures de la greffe: "le rejet". Plus les CMH sont ressemblants, plus la greffe a des chances de réussite.

Inconvénients :

transmission possibles : pathologies bactérienne ou virales (VIH, hépatite)

altération de l’ostéo-induction par stérilisation (rayons gamma)

réaction immunitaire, même si le greffon est irradié

ostéo-conduction aléatoire au sein du greffon.

 

Les matériaux synthétiques:

 

Les matériaux utilisés peuvent être :

  • Les aciers inoxydables; le titane; les alliages (cobalt; chrome; molybdène; tantale)

  • Les céramiques (des oxydes, des sulfures, des borures, des nitrures, des carbures, des composés intermétalliques, ...)

  • Les polymères.

  • Les ACIERS:

​​

Ils sont utilisés quand les volumes à traiter sont importants. Ce matériau est utilisé principalement en chirurgie orthopédique, pour réaliser des implants dentaires ou dans des stimulateurs cardiaques.

Les avantages:

la bonne adhérence du titane à l'os. 

 

Les problèmes:

  • La corrosion électrochimique et durabilité
  • Le mécanisme de dégradation non électrochimique
  • La réaction immunitaire d'hypersensibilité
  • L'adaptation des propriétés mécaniques
  • Les propriétés de frottement et les problèmes de débris

  • Les CERAMIQUES:

Dans le domaine des biomatériaux, on rencontre l'alumine (oxyde d'aluminium Al2O3) et la zircone (dioxyde de zirconium ZrO2) utilisées dans les têtes de prothèses de hanche et en odontologie (implants dentaires), l'hydroxyapatite (HAP de formule chimique: Ca5(PO4)3(OH)) et le phosphate tricalcique (TCPde formule chimique Ca3(PO4)).

Les subtituts osseux en hydroapatite sont apparus en 1980 tandis que ceux de phosphate tricalcique Beta sont apparus en 1982.

L'hydroxyapatite est un constituant essentiel de l'os et ne se résorbe que très lentement. Ils sont ostéophiles, ostéoconducteurs, non résorbables et biocompatibles. Il existe des hydroxyapatites poreuses ou denses.

Phosphate tricalcique : α TCP - β TCP

Forme poreuse du phosphate de calcium. Généralement encapsulé par du tissu conjonctif, le phosphate tricalcique ne stimule pas la croissance osseuse. La forme la plus utilisée en odontologie est la forme β TCP.

Nous pouvons donner l'exemple des produits cyclOS(R), Ceros(R) élaborés par la société Mathys Bettlach SA. Ces implants sont constitués de phosphate tricalcique Beta, ce qui les rendent biocompatibles et sont entierement transformés en tissus osseux au bout de 6 à 8 mois. Ces implants sont utilisés sur  de l'os spongieux et non dans des zones portantes

Les céramiques biphasées associent l'hydroxyapatite Ca(OH)2 et le β TCP Ca3(PO4)2. Le rapport entre hydroxyapatite et le β TCP est variable selon les fabricants.

 

  • Les POLYMERES:

Ciments acryliques

Ils sont élaborées à partir de polyméthylmétacrylate (PMMA) et de

polyhydroxyéthylméthacrylate (PHEMA) associés à de l’hydroxyde de calcium Ca(OH)2.

Ils sont ostéoconducteurs, ostéophiles et hydrophiles.

Les applications:

  • comblement des cavités de curetage de tumeurs
  • fractures pathologiques
  • ciment gentalliné pour combler une perte de substance infectée:(solution d’attente).

 

Polyesters aliphatiques

Ils sont dérivés des acides lactiques et /ou glycériques.

 

Les bioverres

Ces silicates (M2O. x SiO2 avec M : Na, K, Li…) peuvent contenir différents oxydes : Na2O,

CaO, K2O, P2O5… En faisant varier les proportions, peuvent être produits des bioverres

résorbables ou non.

Très ostéophiles (ostéo-conducteurs), ils induisent une formation osseuse rapide et réalisent

une barrière retardant la migration épithéliale. Les bioverres présentent une résistance

mécanique beaucoup plus importante que l’hydroxyde de calcium ou le phosphate de

calcium. Une double couche de gel de silicate et de phosphate de calcium se forme à la

surface quand ils sont exposés aux fluides biologiques.​

 

Le sulfate de calcium

C’est le plus ancien des substituts osseux. La première utilisation en 1862 par Dreesman.

Le sulfate de calcium hémihydraté, de formule CaSO4, correspond au “plâtre de Paris”.

Inorganique, ce matériau, non-poreux, se caractérise par une bonne résorbabilité (1 à 2 mois) et présente la possibilité d’inclure des antibiotiques.

Il ne possède pas d’activité ostéo-conductrice et présente une faible résistance mécanique.

 

 

 

Une HYDROXYAPATITE BIOLOGIQUE:

 

Ce sont des xénogreffes céramisées à très haute température et transformées en hydroxyapatites biologiques, minéral constitutif de l’os.

Exemple d'application:

L'hydroxyapatite biologique (HA) a été obtenue à partir d'arêtes de poissons, disponibles en tant que coproduits de la pêche. Des arêtes d'espadon et de thon ont été nettoyées et soumises à un traitement thermique. Le matériau obtenu à 600°C est une HA des type B et à 950°C un matériau biphasique (HA biologique/ß-TCP ratio 87/13). Des tests in vitro ont montré que les matériaux obtenus ne sont pas cytotoxiques.Ces biomatériaux peuvent servir d'implants en chirurgie osseuse et dentaire, et   contrairement à l'apatite synthétique ils renferment du magnésium et du strontium, ce qui est bénéfique pour les applications médicales.

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Les biotechnologies au service des bioraffineries

31 Mai 2013 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

  • Définition de la bioraffinerie:
  • La bioraffinerie  est un ensemble industriel localisé sur un même site qui transforme  la biomasse en source d'énergie ou de chaleur, en produits chimiques, en alimentations humaines ou animales et en biomatériaux.Il existe 4 types de bioraffinerie:
  • les bioraffineries céréalières
    •  exemple: la valorisation des constituants de la paille de blé par la société CIMV afin de produire des lignines linéraires, de la cellulose et des sirops de sucres qui pourront servir à produire pour le premier, des résines utilisées dans les adhésifs , pour le second, du papier et en ce qui concerne le dernier des aliments pour animaux  ou des biocarburants.
  • les bioraffineries sucrières
    • exemple: la valorisation des constituants de la canne à sucre ou de betterave sucrière afin de produitre du bioéthanol (biocarburant), alimentation humaine et animale, additifs pour colles et substrat de fermentation. Le co-produit de la betterave appelé pulpe est utilisé en nutrition animale, le co-produit de la canne à sucre appelé la bagasse sert à la production d'énergie.
  • les bioraffineries oléagineuses
    • Exemple: la valorisation des constituants du colza et du tournesol par la société SAIPOL afin de produire des huiles destinées à l'élaboration de biodiesel ou de biolubrifiants, mais aussi pour l'alimentation (des huiles, des farines riches en protéines utilisées dans l'alimentation humaine et animale). 
  • les bioraffineries lignocellulosiques
    • exemple: la valorisation des constituants provenant des ressources sylvicoles (forêts), plantes herbacées (miscanthus) ou à fibres (chanvre, lin), ainsi que des ressources résiduelles provenant des secteurs agricoles, forestiers et de l'industrie papetière.

objectifs

  • valoriser l’intégralité des constituants de la plante, et ainsi valoriser les déchets et sous-produits de l’agriculture en s'inspirant du mode de fonctionnement du métabolisme cellulaire.
  • utiliser de la biomasse variée afin deproduire une multitude de produits : molécules, matériaux, ingrédients alimentaires... 

Définition de la biomasse:

La biomasse représente l'ensemble de la matière organique. Elle peut être d'origine animale, végétale et même fongique. Elle peut provenir des forêts, du milieu marin, d'industries produisant des co-produits, des déchets ou des effluents d'élevage.

Les avantages dans l'utilisation d'une telle source sont :

son coté  renouvelable, ce qui n'est pas le cas des énergies fossiles (charbon, gaz et pétrole) qui tendent à s'épuiser.

Dégage peu de gaz à effet de serre et réduit la teneur dans les produits finaux des molécules toxiques comme les H.A.P. (Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques), ou les dérivés de phtalates et du formol. 

Rôles des biotechnologies dans le développement des bioraffineries:

utilisation des enzymes (hydrolases) pour fragmenter les macromolécules issues de la biomasse.

Les Avantages dans l'utilisation de ces enzymes sont nombreux par rapport aux procédés chimiques conventionnels:

  • la biodégradation a lieu à des températures douces
  • les rendements sont meilleurs
  • Il y a moins de réactions parasites
  • Moins énergivore
  • n'engendre pas de dégradation partielle ou totale de certains constituants de la biomasse. En effet , la voie chimique peut détruire les sucres fermentescibles, xylose et arabinose, ce qui constitue une perte de valeur importante. De plus, la dégradation du xylose et de l'arabinose provoque la formation de composés furfuraux. Ces molécules sont toxiques pour les levures fermentaires qui sont utilisées lors de la conversion des sucres en bioéthanol. 

Exemples:

l'hydrolyse  de l'amidon pour donner du glucose. l'hydrolyse débute par une enzyme α-amylase qui brise les liens α(1-4)glycosidiques à l'intérieur des chaînes de l'amylose et de l'amylopectine pour  donner de façon aléatoire des dextrines (les dextrines sont des glucides solubles et amorphes, de formule brute (C6H10O5)n), des oligosaccharides et des monosaccharides. Les oligosaccharides sont hydrolysés ensuite, par la glucoamylaseou du β-amylase pour donner du glucose (hexose) et du maltose (diholoside de glucose).

l'hydrolyse de la lignocellulose en glucose. Les parois cellulaires secondaires des tissus du bois et des herbes sont composées majoritairement de cellulose (40%), d'hémicelluloses (20%), de pectines et de la  lignine. Son hydrolyse s'en trouve donc plus complexe à mettre en oeuvre.

  • La  cellulase va couper en différents points les chaines de glucose liées en β(1→4) que présentent la cellulose.(schéma) Le degré de polymérisation de la cellulose varie entre 400 et 14000 en fonction des différentes espèces végétales.

La β-glucosidase finalise la découpe des fragments en molécules de glucose.

  • L'hémicellulose  est un polymère branché avec différents types de sucres. Il ne contient pas que des glucoses anhydres. Il est  peut être composé de xylose, de mannose ,de galactose de rhamnose ou d'arabinose et de sucres acides comme les acides mannuronique et galacturonique. Les enzymes dégradant les hémicelluloses, comme les xylanases ou les arabinofuranosidases, possèdent un fort potentiel en tant que biocatalyseurs dans des applications industrielles. Ces enzymes sont déjà employées dans des secteurs variés comme l'industrie du papier dans l'étape du blanchiment de la pâte à papier, l'alimentation animale où elles permettent d'accroître la valeur nutritionnelle, l'industrie du vin pour favoriser la libération des arômes, etc. De plus, les hémicellulases apparaissent comme des éléments essentiels dans le futur développement de bioraffineries qui convertiront les déchets agricoles en carburant et autres produits chimiques.La xylanase est le nom donné à une classe d'enzymes qui dégradent le polysaccharide linéaire beta-1 ,4-xylane en xylose, brisant ainsi l'hémicellulose, l'un des principaux composants des parois cellulaires végétales. Les arabinofuranosidases sont des enzymes qui libèrent les résidus L-arabinoses à partir des hémicelluloses d'origine végétale: soit des homopolymères comme les arabinanes (constituants des pectines), soit des hétéropolymères tels que les arabinogalactanes (constituants des pectines), la gomme arabique et les hétéroxylanes (constituent la plus grande fraction des hémicelluloses).
  • La lignine est après la cellulose, la matière organique renouvelable la plus abondante. Elle forme un réseau amorphe tridimensionnel hydrophobe complexe formé à partir de 3 unités différentes de type phénylpropane: les alcools p-coumarylique, coniférique et sinapylique. A l'inverse de la cellulose, la lignine ne comporte pas de motifs répétitifs et possède une grande diversité de liaisons intermonomères.La lignine reste hydrolysée en priorité par des traitements thermochimiques.  

production par fermentation de molécules plateformes

Cette pratique nécessite l'usage de souches microbiennes.

La constitution d'une souchothéque afin d'identifier les souches microbiennes les plus appropriées  pour le développement sur certains substrats et la production de certaines molécules. 

L'usage des technique de biologie moléculaire et de génie génétique afin de surexprimer les gènes d'un même micro-organisme ou de faire exprimer des gènes d'une espèce dans une autre et donc de transplanter une étape ou une nouvelle voie métabolique dans une bactérie ou une levure dont on connaît et maîtrise parfaitement le métabolisme de base.

 

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L'auxine une phytohormone pas comme les autres.

14 Novembre 2012 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

La découverte de cette phytohormone:

En 1880, Francis Darwin étudie le phénomène de la courbure phototropique du coléoptile d'avoine. Chez les poacées, les feuilles sont cachées par une sorte d'étui appélée coléoptile. Lors de la germination le coléoptile est capable d'orienter sa croissance en fonction de la lumière. Cette capacité d'orientation s'appelle le phototropisme.

Il a ainsi pu observer qu'en plaçant une plantule dans une boite fermée et en perçant celle-ci d'un petit trou pour laisser entrer une lumière unidirectionnelle, le coléoptile se courbe vers la source de lumière. La phase opposée à la lumière croit plus vite que celle au contact de la lumière. Si on coupe le sommet du coléoptile, il n'y a plus de courbure, même chose si on place un cache sur le coléoptile.

Par ces résultats, il en conclue que le stimulus est produit  dans la partie haute du coléoptile et il est transmis vers le site d'action (la courbure) dans une partie plus basse.

 

darwin

 

En 1913, Boysen-Jensen sépare le coléoptile de la tige par un bloc de gélose. Il observe une courbure du coléoptile. Il en conclut que la substance induisant la courbure du coléoptile a migré à travers le bloc de gélose.  Il remplace le bloc de gélose par des blocs de mica, de platine et par du beurre de cacao. Il observe l'absence de courbure du coléoptile. Ils en conclue que la substance n'est pas de nature électrique, ni liposoluble. Cette substance est de nature hydrosoluble. 

 

En 1919, Arpad Paal et en 1923 Soding  placent la plaque de mica sur le coté de la tige opposée à la lumière. Ils observent un arrêt de la courbure. A l'inverse, si la plaque de mica est placée sur le coté de la tige face à la lumière, la courbure est conservée. Ils en concluent que la substance migre à des concentration plus importante du coté placé à l'obscurité par rapport à celui face à la lumière provoquant ainsi la courbure vers la source de lumière.

 

En 1926, Went dépose des bouts de coléoptiles sur un bloc de gélose. L'ensemble des coléoptiles et du bloc de gélose est ensuite déposé sur l'un des cotés de la tige préalablement décapitée. Le tout est ensuite placé dans une obscurité totale. Il observe la courbure de la tige du coté ou le bloc a été déposé. Il constate que l'angle de la courbure dépend  du nombre de sommet de coléoptiles. Il en conclue que la courbure est fonction de la concentration du messager. 

 

En 1931, Kogl et Haagen Smit identifient la structure chimique du messager qui porte le nom d'auxine (acide 3 indole acétique ou AIA). Il possède une chaine acétique et un noyau indole. 

 

Structure chimique:

Il existe 2 types d'hormones:

les hormones d'origine naturelle (elles sont produites par les plantes) sont  l'acide indole-3-acétique, l'acide 3-indole-butyrique et l'acide 4-chloro 3-indole acétique, de structures proches, ou encore l'acide phénylacétique qui ne présente toutefois qu'une faible activité auxinique. 

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Acide indole-3-acétique

Les hormones d'origine synthétique, l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D), l'acide 2-méthoxy-3,6-dichlorobenzoïque (Dicamba), l'acide 2,4,5-trichlorophenoxyacétique (2,4,5-T) ou encore l'acide 1-naphtalène acétique (1-ANA).   


Qu'elles soient naturelles ou synthétiques, le dénominateur commun à l'ensemble des auxines, semble résider dans la distance fixe (0,55nm) entre la charge négative portée par le carboxyle (sous sa forme dissociée) et une charge positive plus faible portée par le reste de la structure.  


Pourquoi utiliser des hormones d'origine synthétique? 

L'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique est une hormone puissante. Elle peut être utilisée comme herbicide. Si on dose fortement l'auxine, celle-ci induit la chute des feuilles.

En culture in vitro, le fragment de plante ne possède pas toutes les hormones lui permettant une régénération d'une plante entière. On utilise des hormones de type ANA, 2,4D qui sont stables et pour un coût moindre.

 

Utilisation d'hormones anti-auxine:

 Ce sont des molécules à structures proches des auxines  qui occupent les sites récepteurs de l’AIA ou un site particulier du récepteur sans induire la suite des événements et la chaîne de transduction du signal auxine.

Ces substances rentrent en compétiton avec l’auxine.
Exemple de composé anti-auxine: 2-4-6 trichlorophénoxyacétique.
 
Méthodes de dosage de l'hormone:
Le test de Went utilisé en 1926 (cf la découverte de cette hormone) est un test biologique puisqu'il dose la concentration de l'auxine en fonction de l'effet physiologique qui est l'intensité de la  courbure de la tige.
Cette méthode est très facile à mettre en oeuvre et pour un coût faible mais il est peu précis.On détecte de 10-4g/l à 10-5g/l.

La méthode immunologique consiste à doser la concentration de l'auxine grâce au test ELISA  on dépose dans un plaque multipuits l'extrait végétal contenant une certaine concentration d'auxine à doser. L'ensemble est placé à l'étuve afin que l'auxine s'attache sur le plastique. Ensuite on vide l'extrait. On amène les anticorps anti-auxinique qui reconnaissent la forme des molécules auxiniques et se fixent dessus. On procède à un rinçage. On dirige un deuxième anticorps  contre l'anticorps anti-auxinique. Cette anticorps possède une enzyme qui au contacte de son substrat incolore va interragir avec celui-ci et le colorer. Le dosage de la concentration de l'auxine est fonction de la quantité de l'anticorps anti-anticorps auxinique c'est à dire en fonction de l'activité enzymatique qu'il porte.La détection de l'activité enzymatique se fait à l'aide d'un spectrophotométre.
Cette méthode est beaucoup plus précise on détecte à 10-9 g/l.

La méthode HPLC (High-performance liquid chromatography) couplée avec un spectrofluorimétre. On fait traverser l'extrait végétal avec une certaine concentration d'auxine à doser à travers une colonne contenant un gèle de silice à l'aide d'un solvant (souvent du méthanol et de l'eau). Certains composés traînent dans la colonne d'autres passent plus vite. A la sortie le détecteur spectrofluorimétrique repère Les différents composés de notre extrait dont l'auxine à doser. Le résultat graphique apparaît sous forme de spectre fluorescent en fonction du temps de migration dans la colonne. Il suffit de repèrer le pic correspondant à l'auxine en réalisant un témoin à partir d'auxine commercial et par comparaison repérer le pic qui nous intéresse. La surface de ce pic et fonction de la concentration d'auxine dans l'extrait. On peut également utiliser un autre détecteur comme un spectromètre de masse.
Cette méthode est encore plus précise. On détecte à 10-12g/l. 

Localisation de cette hormone:
On estime que la concentration de l'auxine en moyenne est de 10-9g/g de tissus.
Ces sites de synthèse sont les bourgeons foliaires (méristèmes) et à moindre mesure dans les méristèmes racinaires et les tissus agés (feuilles adultes).
En général les cellules en division produisent des auxines et donc n'importe quelles cellules peuvent produire des auxines.


 Effets  physiologiques de cette hormone:
L'étude physiologique d'une hormone nécessite quelques règles à respecter:
  • Le choix de l'auxine: AIA; ANA; 2,4D. Attention, d'une hormone à l'autre les effets peuvent être différents.
  • Le choix du matériel végétal: l'espèce végétale; l'étude sur plante entière ou sur un fragment.
  • Le choix de la concentration de l'auxine: selon les concentrations les effets peuvent être différents.

  •  Elongation cellulaire:

L'auxine stimule l'auxèse (élongation cellulaire). elle active la production de pompes à protons. Ces pompes expulsent des protons dans le milieu extracellulaire ce qui fait diminuer le pH dans la paroi et augmenter le potentiel de membrane (la tension entre les deux côtés de la membrane est plus forte). Il s’agit de l’hypothèse « de la croissance acidodépendante ».L’acidification de la paroi a pour conséquence d’activer les expansines (enzymes) qui coupent les liaisons hydrogène entre les microfibrilles de cellulose et d’autres composants de la paroi cellulaire. L’armature de cellulose se relâche et les polysaccharides de connexion sont séparés, grâce aux enzymes de la paroi cellulaire qui peuvent y accéder plus facilement. La paroi devient plus extensible. L’efflux des protons favorise aussi l’entrée d’ions potassium qui vont, par un mécanisme d’osmose, induire l’entrée d’eau dans la cellule, d’où une augmentation de la pression de turgescence qui s’applique sur la totalité de la paroi par l’intermédiaire du cytoplasme. La cellule peut alors « s’étirer ». La cellulose synthase procède à la reconstruction de la cellulose. 

  • L'auxine stimule les pompes à protons  ATP dépendant en quelques minutes.
  • L'auxine stimule l'entrée d'eau dans la vacuole: elle stimule la synthèse des aquaporines (canaux protéiques à eau qui se trouve dans la membrane).
  • L'auxine joue un rôle sur l'orientation des microtubules.
  • L'auxine active la synthèse des enzymes comme la cellulose synthase en quelques heures.
  • L'auxine inhibe l'élongation des racines. A forte concentration, il y a synthèse d'éthylène dans la plante.
  •  La division cellulaire:

L'auxine stimule la division cellulaire, c'est à dire les mitoses en culture in vitro. Un fragment d'une plante placé dans un milieu nutritif contenant de l'auxine provoque l'apparition de cellules indifférenciées appelées cals. Les cellules d'un tissu différentié doivent se dédifférencier (perte de leurs spécialisations) puis entrer en mitose.

Cas particulier:

Le pouvoir rhizogène de l'auxine. Lorsqu'on place un fragment de racine dans un milieu contenant de l'auxine, on peut observer l'apparition de racines latérales et non une prolifération anarchique. 

Différentiation cellulaire:

L'auxine induit la formation du xylème et du phloème.

  •  Embryogénèse somatique:

  • Les tissus de l'hypocotyle (partie de la tige située entre sa base (collet) et les premiers cotylédons de la plante) en présence de 2,4D provoquent l'apparition de cals. Ces cals sont ensuite placés dans un milieu liquide sans 2,4D . Certains cals vont alors se diviser pour former un embryon sans qu'il n'y ait eu fécondation. Cet effet physiologique trouve son intérêt dans les laboratoires industriels. En effet, il est utilisé pour la sélection de nouvelles variétés.
  •  
  • Tropisme:

phototropisme

géotropisme = croissance orientée selon l'apesanteur.

Les statocytes sont des cellules spécialisées dans la perception de la gravité et situées au niveau de la coiffe des racines. Ces cellules sont caractérisées par la présence d’amyloplastes avec des grains d'amidons, spécialisés, appelés statolithes. Les statolithes sont donc des plastes, c’est-à-dire des organites intracellulaires, excentrés au pôle basal de la cellule par sédimentation (gravité). Ils exercent ainsi une pression sur la membrane des réticulums endoplasmiques, induisant une augmentation du calcium intra-cytoplasmique et l’activation des transporteurs de l’auxine. Les changements de répartition de l’auxine dans la racine provoquent ainsi des variations dans la croissance de celles-ci.

  • Dominance apicale:

Chez la plupart des plantes, les bourgeons axillaires situés juste sous le bourgeon apical ne se développent pas. Le bourgeon apical se développe rapidement vers le haut et les premières ramifications ne se réalisent sous ce bourgeon qu'à une certaine distance. La section du bourgeon apical provoque le développement immédiat des bourgeons axillaires situés en dessous de lui. Tout se passe comme si, en fonctionnement normal, le bourgeon terminal exerçait une action inhibitrice sur les bourgeons axillaires situés en dessous de lui. Ce phénomène est appelé la dominance apicale.

l'auxine appliquée sur la tige sectionnée au niveau d'un bourgeon apical évite le développement des bourgeons axillaires et donc maintient la dominance apicale exercée par le bourgeon apical. A partir de cette expérience, on peut déduire que le bourgeon apical exerce sa dominance par l'intermédiaire de l'auxine. Le bourgeon terminal secrète de l'auxine. Celle-ci circule vers le bas et inhibe le développement des bourgeons axillaires. La concentration d'auxine diminuant progressivement, l'inhibition s'exerce seulement sur une partie plus ou moins grande de la tige, variable selon les plantes.

L'utilisation de mutants auxotrophes pour le tryptophane, possède une dominance apicale faible ce qui conduit à un développement des bourgeons axillaires. La synthèse en auxine étant faible, le bourgeon apical ne peut exercer une inhibition.

  • Développement des fruits:

L'auxine stimule les divisions de l'ovaire.

L'auxine stimule la croissance des fruits.

expérience de Nitsch en 1950:

Si on supprime les akènes (vrais fruits) pendant la croissance de la fraise le faux-fruit (réceptacle floral) se développe peu, j'ai une inhibition de sa croissance.

Si on supprime les akènes d'un coté de la fraise et qu'on les laisse de l'autre coté, la fraise se développe de manière asymétrique. Plus fort développement du coté présentant encore des akènes.

Si on supprime tous les akènes de la fraise et qu'on applique de l'auxine sur le receptacle floral, la croissance de la fraise est normale.L’application d’auxine rétablit le développement de la fraise privée d’akène.

Si on applique de l'auxine sur le fruit en fin de croissance, le fruit murît: c'est la senescence du fruit. On stimule la synthèse d'éthyléne qui permet le murissement.

nitsch

  • Abscission (chute) des feuilles et des fruits:

Dans la partie basse du pétiole se trouve une zone responsable de la chute des feuilles appelée zone génératrice. Les cellules de celle-ci se dédifférencient et entrent en mitose, on obtient une sorte de méristéme où les cellules ont des parois fragiles: c'est la zone de rupture. En présence d'auxine, on inhibe la formation de cette zone génératrice, mais en excès,l'auxine stimule la synthèse d'éthylène et donc favorise la formation de cette zone.

  • Stress abiotique (stress du à l'environnement):

Exemples de stress:

O3 (ozone); UV; déficite hydrique.

En stress hydrique, la plante ferme ses stomates au niveau de l'épiderme des feuilles. La plante produit l'acide abscissique qui déclenche la fermeture des stomates. Les auxines ont l'effet opposé. Elles stimulent l'ouverture des stomates.

 

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Le transfert horizontal chez les bactéries

8 Août 2011 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Definition:


Le transfert horizontal de gènes est un processus dans lequel un organisme intégre du matériel génètique provenant d'un autre organisme sans en être le descendant. Chez les bactéries, le transfert horizontal joue un rôle majeur dans leur diversification. Ce processus est considéré comme un des facteurs principaux de l'augmentation de la résistance des bactéries aux antibiotiques ainsi que la propagation des gènes de virulence.

 

Histoire:

 

 

  Michael Syvanen était parmi les premiers biologistes occidentaux pour explorer la signification potentielle du transfert transversal de gène. Syvanen a édité une série de publications sur le transfert horizontal de gène commençant en 1984, prévoyant que le transfert transversal de gène est un processus qui a formé l'histoire évolutionnaire dès le début de la vie sur terre.

 

Mécanismes  de transfert horizontal:

 

3 mécanismes en découlent:

 

La conjugaison bactérienne: elle consiste en une transmission de plasmides de conjugaison d'une bactérie donneuse à une bactérie receveuse . La bactérie donneuse posséde le plasmide facteur F, codant pour 24 gènes dont les protéines pilines constitutives des pili. Le facteur F est un épisome, car il peut s'intégrer dans le génome bactérien (souches Hfr).
  Lors de la conjugaison, la bactérie  donneuse (F+) ou Hfr va synthétiser des pili, qui vont lui permettre de s'arrimer à une bactérie receveuse ( F-).
  Le plasmide F va ensuite étre répliqué sous forme de simple brin, et la copie transférée vers la bactérie F- "reçeveuse". Comment a lieu ce transfert ? Longtemps considéré comme un canal de transfert, le pili serait maintenant vu comme une premiére étape d'arrimage, avant que les deux bactéries ne se rapprochent et que le transfert s'effectue par accolement des membranes.
  Lorsque l'épisome est inclu dans le génôme (souches Hfr), une partie du génôme bactérien est copié et transféré à la bactérie reçeveuse. Théoriquement, une copie totale du génôme devrait étre ainsi transférée. Mais ceci reste théorique, car la conjugaison n'est pas maintenue assez longtemps pour celà. Les gènes ont une probabilité de copie et de transfert plus forte s'ils sont situés à proximité de l'épisome.
  L'ADN simple brin transféré est ensuite transformé en double brin. Un double crossing-over permet d'intégrer les exogénes homologues dans le génôme de la bactérie reçeveuse. L'ADN exogéne linéaire après cet épisode ne peut se maintenir dans la bactérie, et finira par étre dégradée.
  La bactérie reçeveuse est devenue recombinante et a intégré des exogénes dans son génôme ou dans le plasmide F 

 

Les gènes codés par les plasmides de conjugaison confèrent diverses propriétés biologiques aux bactéries : résistance aux antibiotiques, résistance aux antiseptiques, résistance aux métaux lourds, résistance aux bactériophages, acquisition de facteurs de pathogénicité, acquisition de nouvelles propriétés métaboliques, synthèse de bactériocines etc.
Les plasmides de conjugaison (et les gènes portés par ces plasmides) peuvent se transmettre entre bactéries d'une même espèce, mais aussi entre bactéries d'espèces différentes.

 

 

Intérêt:

La conjugaison a permis d'étudier le groupe de liaison entre les gènes (linkage) et de dresser la carte génétique des bactéries.

 

  La transduction est un mécanisme lié aux bactériophages (virus spécifiques des bactéries): en effet, ces virus sont capables d'injecter leur génôme dans la bactérie pour qu'elle le réplique et le traduise. Selon les bactériophages, la transduction est un phénomène généralisé (n'importe quel gène est susceptible d'être transféré à une bactérie réceptrice) ou localisée (le transfert ne concerne que quelques gènes dont la nature est variable selon le bactériophage). Elle produit alors des particules virales, les copies du génôme sont encapsidées et la bactérie est lysée, laissant s'échapper les particules virales. On parle alors de cycle lytique.
  Mais le phage peut être tempéré, et suivre un cycle lysogénique. Dans ce cas l'ADN virale est injectée dans la bactérie et s'insére dans le génôme bactérien. Puis, suivant les conditions, l'ADN sera extrudé du génôme et engagera un cycle lytique.
  Lors de la lyse cellulaire, l'ADN génomique est morcellée, et il arrive que des fragments d'ADN soient encapsidés dans des capsides virales. On obtient alors un phage recombinant, qui, s'il infecte une nouvelle bactérie, ne créra pas de cycle viral, mais permettra une recombinaison homologue par exemple. Des génes peuvent ainsi être transférés de bactéries à bactéries via des phages communs.


  La transformation est un évènement assez mal expliqué. Il arrive que les bactéries incorporent de l'ADN et effectuent un événement de recombinaison. Dans d'autres cas, comme lors des applications biotechnologiques, on force la bactérie à incorporer un ADN plasmidique par électroporation. Les bactéries ainsi transformées pourront exprimer les gènes présents sur le plasmide.

 

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