Overblog Suivre ce blog
Administration Créer mon blog
biotechnologie

Articles avec #biotechnologies tag

Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

6 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Principe générale :

Les prises d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont incorporées dans un milieu de culture liquide conçu pour permettre la croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. La croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible (virage d’un indicateur de pH coloré).

 

Principe de la méthode du nombre le plus probable:

cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organismes supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire.

L’estimation de la densité  bactérienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs dilutions successives de la suspension bactérienne originelle dans des milieux de cultures liquides. Il s’agit d’une méthode quantique et non pas énumératif.

 

Protocole expérimental d'une dilution successive de facteur 10:

Matériel:

  •  5 tubes contenant 9 mL de diluant (eau distillée en général sauf indication contraire: eau physiologique, eau peptonée, tryptone-sel, ...).
  • 5 pipettes stériles en plastique de 1mL
  • 1 vortex (facultatif)

Réalisation de la dilution  de facteur 10:

  • Homogéneiser la suspension microbienne à prélever (agitation par mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à l'aide d'un vortex).
  • Ouvrir et flamber l'ouverture du tube.
  • Prélever 1mL de suspension à l'aide de la pipette plastique stérile (ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1cm).
  • Flamber et refermer le tube.
  • Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, flamber l'ouverture y introduire le volume prélevé (éviter tout contact entre la pipette contenant l'inoculum et le diluant stérile).
  • Flamber et refermer le tube.
  • Jeter la pipette souiller dans le bac à eau de javel.

La dilution suivante s'effectue comme la dilution décrite ci-dessus mais en partant du tube de la dilution précédente.

Exemple: 

La dilution 10-5 sera effectué en prenant 1mL de la dilution 10-4 préalablement  homogenéïsée qui sera introduit dans un tube contenant 9 mL de diluant.

L'utilisation de cette méthode avec un tube par dilution entraîne une forte incertitude que des methodes statistiques tentent de pallier par des essais multiples (2 ou 3 tubes par dilution).

Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

 

Observation des résultats:

 

La seule manière de savoir si un micro-organisme est présent ou non dans l'inoculum par les techniques en milieu liquide sera de le mettre en évidence par un de ses caractères:  trouble et production de en gaz en BLBVB (bouillon lactose bilie au vert brillant).

 

Si l'un de ses caractères apparait, le résultat sera positif.

L'absence de l'un de ses caractères, le résultat sera négatif.

 

exemple de resultat:

Volume de l'inoculum: 1mL  Produit pur 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultat + + + + - -

Il y a au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-3  et moins d'un micro-organisme dans 1mL  de la dilution 10-4 et donc on peut en déduire qu'il y a au moins 103 micro-organismes mais moins de 104 micro-organismes dans 1mL de produit pur.

Résultat avec des essais multiples (3 tubes par dilution):

 

Dilution produit pur 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultats +++ +++ +++ ++- +-- ---
Chiffre égal à la somme des tubes positifs 3 3 3 2 1 0

Interprétation statistique: méthode du NPP (table de Mac Grady):

 

Dans la ligne "chiffre égal à la somme des tubes positifs", choisir le nombre à 3 chiffres le plus grand possible et inférieur à 330 (meilleur répartition dans les dilutions).

Se reporter au table de Mac Grady pour 3 tubes de dilution afin de trouver le NPP correspondant au nombre 321: le NPP est 15.

Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10--2  mL. D’après les limites de confiance données par certaines tables, cette valeur numérique de 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38 avec une probabilité de 95 %, entre 2 et 52 avec une probabilité de 99 %. 

Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

En déduire la concentration en micro-organismes par mL de produit pur N.

NPP= nombre le plus probable obtenu par lecture de la table de Mac Grady

V inoculum= 1 mL

Fd= facteur de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique 10-2

 

N= NPP /V inoculum * Fd

15/0,01 =15 102  micro-organismes par mL

Lire la suite

Analyse des coliformes dans les eaux

4 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Les bactéries coliformes existent dans les matières fécales mais peuvent également se développer dans certains milieux naturels (sols, eau, végétation): l'absence de coliformes totaux ne signifie pas nécessairement que l'eau ne présente pas de risque pathogène. Les bactéries coliformes qui peuplent l'intestin peuvent être identifiées par leur tolérance à une température de 44-45°C. La présence de ces coliformes thermotolérants est une preuve indiscutable d'une contamination par matières fécales.

Ces bactéries coliformes sont des bactéries en bâtonnet, Gram négatifs, oxydase négatif, aérobies ou anaérobies facultatifs. Les coliformes thermotolérants sont les colibacilles et E coli.

 

La norme: 0/100mL d'eau

 

Protocole expérimental:

On procède à la filtration sur membrane de 100mL d'eau puis la membrane est mise en culture sur une gélose nutritive.

Matériel:

  • Matériel de stérilisation (four, autoclave ou autocuiseur).

  • Etuve ou enceinte thermostatée 37°C+/- 1°C.

  • Matériel de microbiologie: boites de pétri stériles, pipettes 1mL stériles (usage unique), flacons stériles.

  • Système de filtration sur membrane et membranes stériles, trompe à vide.

  • Gélose au Tergitol 7.

 

Travail préparatoire:

  • Préparation de la gélose et conservation.

Suivre les indications fournies avec la gélose au Tergitol 7, stériliser en flacons de 100 mL à 200 mL.

 

  • En zone stérile

Couler la gélose dans les boites de pétri petit diamètre. Laisser refroidir couvercle en partie ouvert. Quand la gélose est solide, fermer la boite et placer au réfrigérateur, gélose vers le haut.

 

  • Stérilisation des flacons de prélèvement

Mettre du coton cardé (hydrophobe) sur l'embouchure, recouvrir de papier aluminium. Stériliser au four à 170°C pendant 1 heure ; à l'autoclave à 120°C pendant 20 min ; dans une cocotte minute contenant un peu d'eau pendant 40 minutes après la mise en rotation de la soupape.

 

  • Stériliser le système de filtration, ou seulement la partie supérieure qui recueille l'échantillon d'eau. Entourer la partie à stériliser de papier aluminium. Après stérilisation, conserver dans le papier aluminium.

 

Prélèvement:

  • Eau de rivière, de puits, etc.

Attacher la bouteille stérile à une corde, lester. Maintenir la bouteille dans l'eau à la profondeur souhaitée. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium.

 

  • Eau du robinet.

Nettoyer le robinet avec un tissu propre, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min. Stériliser à la flamme (briquet, lampe alcool) l'embouchure du robinet, laisser couler l'eau pendant 1 à 2 min.
Remplir le flacon en laissant un peu d'air. Boucher avec le coton cardé conservé dans le papier aluminium. Conserver l'échantillon au réfrigérateur, ensemencer le plus vite possible.

 

Filtration sur membrane:

  • Préparer une zone stérile : placer autour du bec Bunsen les boites de pétri avec gélose au Tergitol 7 et les pipettes stériles.
  • Placer la membrane stérile sur le système de filtration.
  • Mettre en place la trompe à vide.
  • Agiter le flacon vigoureusement.
  • Verser 100 mL d'échantillon d'eau et filtrer en aspirant avec une trompe à vide.

 

Ensemencement:

  • Mise en culture en zone stérile.
    Ouvrir le système de filtration et retirer la membrane avec une pince stérile.
    Déposer la membrane sur la gélose, face contaminée en haut. Les éléments nutritifs de la gélose traversent la membrane, ce qui permet le développement des bactéries en surface.

 

Incubation:

  • Placer les boites à l'étuve à 37°C (incuber les boîtes couvercle vers le bas pour que la condensation s'accumule dans le couvercle) .
    Pour la recherche de coliformes, placer les boîtes à 37°C pendant 24 et 48 heures.
    Pour la recherche de coliformes thermotolérants, placer les boîtes à 44°C pendant 24 et 48 heures.

 

Résultats:

  • Identification des colonies et dénombrement

Le dénombrement des bactéries repose sur le principe selon lequel une colonie se forme par divisions d'un seul micro-organisme.
Examiner la membrane à la fin de l'incubation, à travers le couvercle.
Pour des raisons de sécurité, ne jamais ouvrir la boîte.
Coliformes : sont considérées comme caractéristiques les colonies qui présentent une coloration jaune orangé.
Coliformes thermotolérants : sont considérées comme caractéristiques les mêmes colonies que pour les coliformes, mais après incubation à 44°C.
Compter les colonies en marquant chaque colonie sur le fond de la boîte avec un marqueur indélébile.

Lisibilité:

  • Est considérée comme lisible une membrane où sont présentes au plus 100 bactéries. Si le nombre est supérieur, il faut procéder à des dilutions.

 

Calcul:

  • Exprimer le résultat en nombre de bactéries par 100 mL. Tenir compte de la dilution éventuelle.

 

Décontamination:

  • Ouvrir les boîtes au laboratoire, les décontaminer à l'autoclave à 120°C pendant 20 minutes ou dans l'eau de Javel diluée (un berlingot de 250 mL complété à 1 L avec de l'eau distillée) pendant 24 heures.
Lire la suite

Biomatériaux

21 Octobre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Définition:

Tout matériau, naturel ou non, comprenant tout ou partie d'une structure vivante ou d'un appareil biomédical qui exécute ou remplace une fonction naturelle.

Histoire:

  • Van Meek’ren (1668): xénogreffe de voûte crânienne à partir d’un crâne de chien
  • Autogreffe en 1810 par Van Merren
  • Allogreffe: problème de conservation (Ollier 1867)

Les matériaux naturels:

  • Une AUTOGREFFE : greffe des propres tissus d’un individu à lui-même.

Les sites de prélèvement sont l'os iliaque, le ramus, la zone rétromolaire et l'os pariétal.

La résorption du greffon peut être faible à importante, voire totale : l'origine embryologique et le mode d’ossification du site de prélèvement sont prépondérants.

Le taux de réussite de ce type de greffe est maximal, étant donné que le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) du donneur et du receveur est le même. Aucune réaction immunitaire n'est déclenchée.

 

  • Une XENOGREFFE : greffe des tissus d’un individu à un autre d’une autre espèce.

Le porc est l'un des meilleurs animaux donneurs d'organes pour l'humain, en raison notamment de sa disponibilité et de la taille de ses organes mais nous pouvons également utiliser comme donneurs le corail, la seiche et les mammifères (cheval, vache, cochon, mouton).

Leur indication réside dans les zones soumises à des contraintes (propriétés mécaniques intéressantes), mais non utilisables pour les grandes pertes de substance.

Le risque de transmission (virus, prions) est faible, mais non nul. Les traitements consistent en l’élimination des débris cellulaires, la déproténéisation, la délipidation, l’inactivation des virus et des prions, une stérilisation par irradiation.

Cette technique est encore expérimentale pour les organes et les cellules. Elle est appelée à se développer en raison de la pénurie d'organes humains pour les allogreffes. Elles est en concurrence avec d'autres voies de recherche qui sont la substitution mécanique des organes déffaillants («coeur artificiel») et les cellules souches.

 

Dans les xénogreffes, nous pouvons cité les exemples suivants:

 l'hydroxyapatite biologique:

Ce sont des xénogreffes céramisées à très haute température et transformées en hydroxyapatites biologiques, minéral constitutif de l’os.

Exemple d'application:

L'hydroxyapatite biologique (HA) a été obtenue à partir d'arêtes de poissons, disponibles en tant que coproduits de la pêche. Des arêtes d'espadon et de thon ont été nettoyées et soumises à un traitement thermique. Le matériau obtenu à 600°C est une HA des type B et à 950°C un matériau biphasique (HA biologique/ß-TCP ratio 87/13). Des tests in vitro ont montré que les matériaux obtenus ne sont pas cytotoxiques.Ces biomatériaux peuvent servir d'implants en chirurgie osseuse et dentaire, et   contrairement à l'apatite synthétique ils renferment du magnésium et du strontium, ce qui est bénéfique pour les applications médicales.

 

les carbonates de calcium:

Origines : corail, nacre, seiche.

1976: Patat et Guillemin

Le corail naturel est purifié (élimination de la matrice organique) et stérilisé (rayons ionisants β). Ce matériau correspond à un carbonate de calcium, de formule CaCO3, cristallisé sous forme d’aragonite. Différentes espèces sont utilisées selon leurs caractéristiques structurales et les indications cliniques : le corail Porites lutea est préconisé en Odontologie.

D’une porosité de 100 à 200 microns, similaire à celles de l’os spongieux, le carbonate de calcium est biocompatible et résorbable.

La cinétique de résorption dépend de l’espèce, du site d’implantation, du volume, de la taille et du volume des pores. Le processus est lié à l’action des cellules et des ostéoclastes, ainsi qu’à l’action des fluides interstitiels (dissolution de surface).

Son rôle mécanique de soutien lui confére des utilisations multiples (fractures, rachis …). On note un problème de tolérance locale si non-céramisé.

 

  • Une ALLOGREFFE : greffe des tissus d’un individu à un autre d’une même espèce.

Etant deux individus distincts, donneur et receveur possèdent des complexes majeurs d'histocompatibilité (CMH) différents. Dans ces cas, la greffe s'accompagne d'un traitement immunosuppresseur visant à prévenir une des complications majeures de la greffe: "le rejet". Plus les CMH sont ressemblants, plus la greffe a des chances de réussite.

Inconvénients :

transmission possibles : pathologies bactérienne ou virales (VIH, hépatite)

altération de l’ostéo-induction par stérilisation (rayons gamma)

réaction immunitaire, même si le greffon est irradié

ostéo-conduction aléatoire au sein du greffon.

 

Les matériaux synthétiques:

 

Les matériaux utilisés peuvent être :

  • Les aciers inoxydables; le titane; les alliages (cobalt; chrome; molybdène; tantale)

  • Les céramiques (des oxydes, des sulfures, des borures, des nitrures, des carbures, des composés intermétalliques, ...)

  • Les polymères.

  • Les ACIERS:

​​

Ils sont utilisés quand les volumes à traiter sont importants. Ce matériau est utilisé principalement en chirurgie orthopédique, pour réaliser des implants dentaires ou dans des stimulateurs cardiaques.

Les avantages:

la bonne adhérence du titane à l'os. 

 

Les problèmes:

  • La corrosion électrochimique et durabilité
  • Le mécanisme de dégradation non électrochimique
  • La réaction immunitaire d'hypersensibilité
  • L'adaptation des propriétés mécaniques
  • Les propriétés de frottement et les problèmes de débris

  • Les CERAMIQUES:

Dans le domaine des biomatériaux, on rencontre l'alumine (oxyde d'aluminium Al2O3) et la zircone (dioxyde de zirconium ZrO2) utilisées dans les têtes de prothèses de hanche et en odontologie (implants dentaires), l'hydroxyapatite (HAP de formule chimique: Ca5(PO4)3(OH)) et le phosphate tricalcique (TCPde formule chimique Ca3(PO4)).

Les subtituts osseux en hydroapatite sont apparus en 1980 tandis que ceux de phosphate tricalcique Beta sont apparus en 1982.

L'hydroxyapatite est un constituant essentiel de l'os et ne se résorbe que très lentement. Ils sont ostéophiles, ostéoconducteurs, non résorbables et biocompatibles. Il existe des hydroxyapatites poreuses ou denses.

Phosphate tricalcique : α TCP - β TCP

Forme poreuse du phosphate de calcium. Généralement encapsulé par du tissu conjonctif, le phosphate tricalcique ne stimule pas la croissance osseuse. La forme la plus utilisée en odontologie est la forme β TCP.

Nous pouvons donner l'exemple des produits cyclOS(R), Ceros(R) élaborés par la société Mathys Bettlach SA. Ces implants sont constitués de phosphate tricalcique Beta, ce qui les rendent biocompatibles et sont entierement transformés en tissus osseux au bout de 6 à 8 mois. Ces implants sont utilisés sur  de l'os spongieux et non dans des zones portantes

Les céramiques biphasées associent l'hydroxyapatite Ca(OH)2 et le β TCP Ca3(PO4)2. Le rapport entre hydroxyapatite et le β TCP est variable selon les fabricants.

 

  • Les POLYMERES:

Ciments acryliques

Ils sont élaborées à partir de polyméthylmétacrylate (PMMA) et de

polyhydroxyéthylméthacrylate (PHEMA) associés à de l’hydroxyde de calcium Ca(OH)2.

Ils sont ostéoconducteurs, ostéophiles et hydrophiles.

Les applications:

  • comblement des cavités de curetage de tumeurs
  • fractures pathologiques
  • ciment gentalliné pour combler une perte de substance infectée:(solution d’attente).

 

Polyesters aliphatiques

Ils sont dérivés des acides lactiques et /ou glycériques.

 

Les bioverres

Ces silicates (M2O. x SiO2 avec M : Na, K, Li…) peuvent contenir différents oxydes : Na2O,

CaO, K2O, P2O5… En faisant varier les proportions, peuvent être produits des bioverres

résorbables ou non.

Très ostéophiles (ostéo-conducteurs), ils induisent une formation osseuse rapide et réalisent

une barrière retardant la migration épithéliale. Les bioverres présentent une résistance

mécanique beaucoup plus importante que l’hydroxyde de calcium ou le phosphate de

calcium. Une double couche de gel de silicate et de phosphate de calcium se forme à la

surface quand ils sont exposés aux fluides biologiques.​

 

Le sulfate de calcium

C’est le plus ancien des substituts osseux. La première utilisation en 1862 par Dreesman.

Le sulfate de calcium hémihydraté, de formule CaSO4, correspond au “plâtre de Paris”.

Inorganique, ce matériau, non-poreux, se caractérise par une bonne résorbabilité (1 à 2 mois) et présente la possibilité d’inclure des antibiotiques.

Il ne possède pas d’activité ostéo-conductrice et présente une faible résistance mécanique.

 

 

 

Une HYDROXYAPATITE BIOLOGIQUE:

 

Ce sont des xénogreffes céramisées à très haute température et transformées en hydroxyapatites biologiques, minéral constitutif de l’os.

Exemple d'application:

L'hydroxyapatite biologique (HA) a été obtenue à partir d'arêtes de poissons, disponibles en tant que coproduits de la pêche. Des arêtes d'espadon et de thon ont été nettoyées et soumises à un traitement thermique. Le matériau obtenu à 600°C est une HA des type B et à 950°C un matériau biphasique (HA biologique/ß-TCP ratio 87/13). Des tests in vitro ont montré que les matériaux obtenus ne sont pas cytotoxiques.Ces biomatériaux peuvent servir d'implants en chirurgie osseuse et dentaire, et   contrairement à l'apatite synthétique ils renferment du magnésium et du strontium, ce qui est bénéfique pour les applications médicales.

Lire la suite

Les biotechnologies au service des bioraffineries

31 Mai 2013 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

  • Définition de la bioraffinerie:
  • La bioraffinerie  est un ensemble industriel localisé sur un même site qui transforme  la biomasse en source d'énergie ou de chaleur, en produits chimiques, en alimentations humaines ou animales et en biomatériaux.Il existe 4 types de bioraffinerie:
  • les bioraffineries céréalières
    •  exemple: la valorisation des constituants de la paille de blé par la société CIMV afin de produire des lignines linéraires, de la cellulose et des sirops de sucres qui pourront servir à produire pour le premier, des résines utilisées dans les adhésifs , pour le second, du papier et en ce qui concerne le dernier des aliments pour animaux  ou des biocarburants.
  • les bioraffineries sucrières
    • exemple: la valorisation des constituants de la canne à sucre ou de betterave sucrière afin de produitre du bioéthanol (biocarburant), alimentation humaine et animale, additifs pour colles et substrat de fermentation. Le co-produit de la betterave appelé pulpe est utilisé en nutrition animale, le co-produit de la canne à sucre appelé la bagasse sert à la production d'énergie.
  • les bioraffineries oléagineuses
    • Exemple: la valorisation des constituants du colza et du tournesol par la société SAIPOL afin de produire des huiles destinées à l'élaboration de biodiesel ou de biolubrifiants, mais aussi pour l'alimentation (des huiles, des farines riches en protéines utilisées dans l'alimentation humaine et animale). 
  • les bioraffineries lignocellulosiques
    • exemple: la valorisation des constituants provenant des ressources sylvicoles (forêts), plantes herbacées (miscanthus) ou à fibres (chanvre, lin), ainsi que des ressources résiduelles provenant des secteurs agricoles, forestiers et de l'industrie papetière.

objectifs

  • valoriser l’intégralité des constituants de la plante, et ainsi valoriser les déchets et sous-produits de l’agriculture en s'inspirant du mode de fonctionnement du métabolisme cellulaire.
  • utiliser de la biomasse variée afin deproduire une multitude de produits : molécules, matériaux, ingrédients alimentaires... 

Définition de la biomasse:

La biomasse représente l'ensemble de la matière organique. Elle peut être d'origine animale, végétale et même fongique. Elle peut provenir des forêts, du milieu marin, d'industries produisant des co-produits, des déchets ou des effluents d'élevage.

Les avantages dans l'utilisation d'une telle source sont :

son coté  renouvelable, ce qui n'est pas le cas des énergies fossiles (charbon, gaz et pétrole) qui tendent à s'épuiser.

Dégage peu de gaz à effet de serre et réduit la teneur dans les produits finaux des molécules toxiques comme les H.A.P. (Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques), ou les dérivés de phtalates et du formol. 

Rôles des biotechnologies dans le développement des bioraffineries:

utilisation des enzymes (hydrolases) pour fragmenter les macromolécules issues de la biomasse.

Les Avantages dans l'utilisation de ces enzymes sont nombreux par rapport aux procédés chimiques conventionnels:

  • la biodégradation a lieu à des températures douces
  • les rendements sont meilleurs
  • Il y a moins de réactions parasites
  • Moins énergivore
  • n'engendre pas de dégradation partielle ou totale de certains constituants de la biomasse. En effet , la voie chimique peut détruire les sucres fermentescibles, xylose et arabinose, ce qui constitue une perte de valeur importante. De plus, la dégradation du xylose et de l'arabinose provoque la formation de composés furfuraux. Ces molécules sont toxiques pour les levures fermentaires qui sont utilisées lors de la conversion des sucres en bioéthanol. 

Exemples:

l'hydrolyse  de l'amidon pour donner du glucose. l'hydrolyse débute par une enzyme α-amylase qui brise les liens α(1-4)glycosidiques à l'intérieur des chaînes de l'amylose et de l'amylopectine pour  donner de façon aléatoire des dextrines (les dextrines sont des glucides solubles et amorphes, de formule brute (C6H10O5)n), des oligosaccharides et des monosaccharides. Les oligosaccharides sont hydrolysés ensuite, par la glucoamylaseou du β-amylase pour donner du glucose (hexose) et du maltose (diholoside de glucose).

l'hydrolyse de la lignocellulose en glucose. Les parois cellulaires secondaires des tissus du bois et des herbes sont composées majoritairement de cellulose (40%), d'hémicelluloses (20%), de pectines et de la  lignine. Son hydrolyse s'en trouve donc plus complexe à mettre en oeuvre.

  • La  cellulase va couper en différents points les chaines de glucose liées en β(1→4) que présentent la cellulose.(schéma) Le degré de polymérisation de la cellulose varie entre 400 et 14000 en fonction des différentes espèces végétales.

La β-glucosidase finalise la découpe des fragments en molécules de glucose.

  • L'hémicellulose  est un polymère branché avec différents types de sucres. Il ne contient pas que des glucoses anhydres. Il est  peut être composé de xylose, de mannose ,de galactose de rhamnose ou d'arabinose et de sucres acides comme les acides mannuronique et galacturonique. Les enzymes dégradant les hémicelluloses, comme les xylanases ou les arabinofuranosidases, possèdent un fort potentiel en tant que biocatalyseurs dans des applications industrielles. Ces enzymes sont déjà employées dans des secteurs variés comme l'industrie du papier dans l'étape du blanchiment de la pâte à papier, l'alimentation animale où elles permettent d'accroître la valeur nutritionnelle, l'industrie du vin pour favoriser la libération des arômes, etc. De plus, les hémicellulases apparaissent comme des éléments essentiels dans le futur développement de bioraffineries qui convertiront les déchets agricoles en carburant et autres produits chimiques.La xylanase est le nom donné à une classe d'enzymes qui dégradent le polysaccharide linéaire beta-1 ,4-xylane en xylose, brisant ainsi l'hémicellulose, l'un des principaux composants des parois cellulaires végétales. Les arabinofuranosidases sont des enzymes qui libèrent les résidus L-arabinoses à partir des hémicelluloses d'origine végétale: soit des homopolymères comme les arabinanes (constituants des pectines), soit des hétéropolymères tels que les arabinogalactanes (constituants des pectines), la gomme arabique et les hétéroxylanes (constituent la plus grande fraction des hémicelluloses).
  • La lignine est après la cellulose, la matière organique renouvelable la plus abondante. Elle forme un réseau amorphe tridimensionnel hydrophobe complexe formé à partir de 3 unités différentes de type phénylpropane: les alcools p-coumarylique, coniférique et sinapylique. A l'inverse de la cellulose, la lignine ne comporte pas de motifs répétitifs et possède une grande diversité de liaisons intermonomères.La lignine reste hydrolysée en priorité par des traitements thermochimiques.  

production par fermentation de molécules plateformes

Cette pratique nécessite l'usage de souches microbiennes.

La constitution d'une souchothéque afin d'identifier les souches microbiennes les plus appropriées  pour le développement sur certains substrats et la production de certaines molécules. 

L'usage des technique de biologie moléculaire et de génie génétique afin de surexprimer les gènes d'un même micro-organisme ou de faire exprimer des gènes d'une espèce dans une autre et donc de transplanter une étape ou une nouvelle voie métabolique dans une bactérie ou une levure dont on connaît et maîtrise parfaitement le métabolisme de base.

 

Lire la suite

L'auxine une phytohormone pas comme les autres.

14 Novembre 2012 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

La découverte de cette phytohormone:

En 1880, Francis Darwin étudie le phénomène de la courbure phototropique du coléoptile d'avoine. Chez les poacées, les feuilles sont cachées par une sorte d'étui appélée coléoptile. Lors de la germination le coléoptile est capable d'orienter sa croissance en fonction de la lumière. Cette capacité d'orientation s'appelle le phototropisme.

Il a ainsi pu observer qu'en plaçant une plantule dans une boite fermée et en perçant celle-ci d'un petit trou pour laisser entrer une lumière unidirectionnelle, le coléoptile se courbe vers la source de lumière. La phase opposée à la lumière croit plus vite que celle au contact de la lumière. Si on coupe le sommet du coléoptile, il n'y a plus de courbure, même chose si on place un cache sur le coléoptile.

Par ces résultats, il en conclue que le stimulus est produit  dans la partie haute du coléoptile et il est transmis vers le site d'action (la courbure) dans une partie plus basse.

 

darwin

 

En 1913, Boysen-Jensen sépare le coléoptile de la tige par un bloc de gélose. Il observe une courbure du coléoptile. Il en conclut que la substance induisant la courbure du coléoptile a migré à travers le bloc de gélose.  Il remplace le bloc de gélose par des blocs de mica, de platine et par du beurre de cacao. Il observe l'absence de courbure du coléoptile. Ils en conclue que la substance n'est pas de nature électrique, ni liposoluble. Cette substance est de nature hydrosoluble. 

 

En 1919, Arpad Paal et en 1923 Soding  placent la plaque de mica sur le coté de la tige opposée à la lumière. Ils observent un arrêt de la courbure. A l'inverse, si la plaque de mica est placée sur le coté de la tige face à la lumière, la courbure est conservée. Ils en concluent que la substance migre à des concentration plus importante du coté placé à l'obscurité par rapport à celui face à la lumière provoquant ainsi la courbure vers la source de lumière.

 

En 1926, Went dépose des bouts de coléoptiles sur un bloc de gélose. L'ensemble des coléoptiles et du bloc de gélose est ensuite déposé sur l'un des cotés de la tige préalablement décapitée. Le tout est ensuite placé dans une obscurité totale. Il observe la courbure de la tige du coté ou le bloc a été déposé. Il constate que l'angle de la courbure dépend  du nombre de sommet de coléoptiles. Il en conclue que la courbure est fonction de la concentration du messager. 

 

En 1931, Kogl et Haagen Smit identifient la structure chimique du messager qui porte le nom d'auxine (acide 3 indole acétique ou AIA). Il possède une chaine acétique et un noyau indole. 

 

Structure chimique:

Il existe 2 types d'hormones:

les hormones d'origine naturelle (elles sont produites par les plantes) sont  l'acide indole-3-acétique, l'acide 3-indole-butyrique et l'acide 4-chloro 3-indole acétique, de structures proches, ou encore l'acide phénylacétique qui ne présente toutefois qu'une faible activité auxinique. 

 auxineblog

Acide indole-3-acétique

Les hormones d'origine synthétique, l'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D), l'acide 2-méthoxy-3,6-dichlorobenzoïque (Dicamba), l'acide 2,4,5-trichlorophenoxyacétique (2,4,5-T) ou encore l'acide 1-naphtalène acétique (1-ANA).   


Qu'elles soient naturelles ou synthétiques, le dénominateur commun à l'ensemble des auxines, semble résider dans la distance fixe (0,55nm) entre la charge négative portée par le carboxyle (sous sa forme dissociée) et une charge positive plus faible portée par le reste de la structure.  


Pourquoi utiliser des hormones d'origine synthétique? 

L'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique est une hormone puissante. Elle peut être utilisée comme herbicide. Si on dose fortement l'auxine, celle-ci induit la chute des feuilles.

En culture in vitro, le fragment de plante ne possède pas toutes les hormones lui permettant une régénération d'une plante entière. On utilise des hormones de type ANA, 2,4D qui sont stables et pour un coût moindre.

 

Utilisation d'hormones anti-auxine:

 Ce sont des molécules à structures proches des auxines  qui occupent les sites récepteurs de l’AIA ou un site particulier du récepteur sans induire la suite des événements et la chaîne de transduction du signal auxine.

Ces substances rentrent en compétiton avec l’auxine.
Exemple de composé anti-auxine: 2-4-6 trichlorophénoxyacétique.
 
Méthodes de dosage de l'hormone:
Le test de Went utilisé en 1926 (cf la découverte de cette hormone) est un test biologique puisqu'il dose la concentration de l'auxine en fonction de l'effet physiologique qui est l'intensité de la  courbure de la tige.
Cette méthode est très facile à mettre en oeuvre et pour un coût faible mais il est peu précis.On détecte de 10-4g/l à 10-5g/l.

La méthode immunologique consiste à doser la concentration de l'auxine grâce au test ELISA  on dépose dans un plaque multipuits l'extrait végétal contenant une certaine concentration d'auxine à doser. L'ensemble est placé à l'étuve afin que l'auxine s'attache sur le plastique. Ensuite on vide l'extrait. On amène les anticorps anti-auxinique qui reconnaissent la forme des molécules auxiniques et se fixent dessus. On procède à un rinçage. On dirige un deuxième anticorps  contre l'anticorps anti-auxinique. Cette anticorps possède une enzyme qui au contacte de son substrat incolore va interragir avec celui-ci et le colorer. Le dosage de la concentration de l'auxine est fonction de la quantité de l'anticorps anti-anticorps auxinique c'est à dire en fonction de l'activité enzymatique qu'il porte.La détection de l'activité enzymatique se fait à l'aide d'un spectrophotométre.
Cette méthode est beaucoup plus précise on détecte à 10-9 g/l.

La méthode HPLC (High-performance liquid chromatography) couplée avec un spectrofluorimétre. On fait traverser l'extrait végétal avec une certaine concentration d'auxine à doser à travers une colonne contenant un gèle de silice à l'aide d'un solvant (souvent du méthanol et de l'eau). Certains composés traînent dans la colonne d'autres passent plus vite. A la sortie le détecteur spectrofluorimétrique repère Les différents composés de notre extrait dont l'auxine à doser. Le résultat graphique apparaît sous forme de spectre fluorescent en fonction du temps de migration dans la colonne. Il suffit de repèrer le pic correspondant à l'auxine en réalisant un témoin à partir d'auxine commercial et par comparaison repérer le pic qui nous intéresse. La surface de ce pic et fonction de la concentration d'auxine dans l'extrait. On peut également utiliser un autre détecteur comme un spectromètre de masse.
Cette méthode est encore plus précise. On détecte à 10-12g/l. 

Localisation de cette hormone:
On estime que la concentration de l'auxine en moyenne est de 10-9g/g de tissus.
Ces sites de synthèse sont les bourgeons foliaires (méristèmes) et à moindre mesure dans les méristèmes racinaires et les tissus agés (feuilles adultes).
En général les cellules en division produisent des auxines et donc n'importe quelles cellules peuvent produire des auxines.


 Effets  physiologiques de cette hormone:
L'étude physiologique d'une hormone nécessite quelques règles à respecter:
  • Le choix de l'auxine: AIA; ANA; 2,4D. Attention, d'une hormone à l'autre les effets peuvent être différents.
  • Le choix du matériel végétal: l'espèce végétale; l'étude sur plante entière ou sur un fragment.
  • Le choix de la concentration de l'auxine: selon les concentrations les effets peuvent être différents.

  •  Elongation cellulaire:

L'auxine stimule l'auxèse (élongation cellulaire). elle active la production de pompes à protons. Ces pompes expulsent des protons dans le milieu extracellulaire ce qui fait diminuer le pH dans la paroi et augmenter le potentiel de membrane (la tension entre les deux côtés de la membrane est plus forte). Il s’agit de l’hypothèse « de la croissance acidodépendante ».L’acidification de la paroi a pour conséquence d’activer les expansines (enzymes) qui coupent les liaisons hydrogène entre les microfibrilles de cellulose et d’autres composants de la paroi cellulaire. L’armature de cellulose se relâche et les polysaccharides de connexion sont séparés, grâce aux enzymes de la paroi cellulaire qui peuvent y accéder plus facilement. La paroi devient plus extensible. L’efflux des protons favorise aussi l’entrée d’ions potassium qui vont, par un mécanisme d’osmose, induire l’entrée d’eau dans la cellule, d’où une augmentation de la pression de turgescence qui s’applique sur la totalité de la paroi par l’intermédiaire du cytoplasme. La cellule peut alors « s’étirer ». La cellulose synthase procède à la reconstruction de la cellulose. 

  • L'auxine stimule les pompes à protons  ATP dépendant en quelques minutes.
  • L'auxine stimule l'entrée d'eau dans la vacuole: elle stimule la synthèse des aquaporines (canaux protéiques à eau qui se trouve dans la membrane).
  • L'auxine joue un rôle sur l'orientation des microtubules.
  • L'auxine active la synthèse des enzymes comme la cellulose synthase en quelques heures.
  • L'auxine inhibe l'élongation des racines. A forte concentration, il y a synthèse d'éthylène dans la plante.
  •  La division cellulaire:

L'auxine stimule la division cellulaire, c'est à dire les mitoses en culture in vitro. Un fragment d'une plante placé dans un milieu nutritif contenant de l'auxine provoque l'apparition de cellules indifférenciées appelées cals. Les cellules d'un tissu différentié doivent se dédifférencier (perte de leurs spécialisations) puis entrer en mitose.

Cas particulier:

Le pouvoir rhizogène de l'auxine. Lorsqu'on place un fragment de racine dans un milieu contenant de l'auxine, on peut observer l'apparition de racines latérales et non une prolifération anarchique. 

Différentiation cellulaire:

L'auxine induit la formation du xylème et du phloème.

  •  Embryogénèse somatique:

  • Les tissus de l'hypocotyle (partie de la tige située entre sa base (collet) et les premiers cotylédons de la plante) en présence de 2,4D provoquent l'apparition de cals. Ces cals sont ensuite placés dans un milieu liquide sans 2,4D . Certains cals vont alors se diviser pour former un embryon sans qu'il n'y ait eu fécondation. Cet effet physiologique trouve son intérêt dans les laboratoires industriels. En effet, il est utilisé pour la sélection de nouvelles variétés.
  •  
  • Tropisme:

phototropisme

géotropisme = croissance orientée selon l'apesanteur.

Les statocytes sont des cellules spécialisées dans la perception de la gravité et situées au niveau de la coiffe des racines. Ces cellules sont caractérisées par la présence d’amyloplastes avec des grains d'amidons, spécialisés, appelés statolithes. Les statolithes sont donc des plastes, c’est-à-dire des organites intracellulaires, excentrés au pôle basal de la cellule par sédimentation (gravité). Ils exercent ainsi une pression sur la membrane des réticulums endoplasmiques, induisant une augmentation du calcium intra-cytoplasmique et l’activation des transporteurs de l’auxine. Les changements de répartition de l’auxine dans la racine provoquent ainsi des variations dans la croissance de celles-ci.

  • Dominance apicale:

Chez la plupart des plantes, les bourgeons axillaires situés juste sous le bourgeon apical ne se développent pas. Le bourgeon apical se développe rapidement vers le haut et les premières ramifications ne se réalisent sous ce bourgeon qu'à une certaine distance. La section du bourgeon apical provoque le développement immédiat des bourgeons axillaires situés en dessous de lui. Tout se passe comme si, en fonctionnement normal, le bourgeon terminal exerçait une action inhibitrice sur les bourgeons axillaires situés en dessous de lui. Ce phénomène est appelé la dominance apicale.

l'auxine appliquée sur la tige sectionnée au niveau d'un bourgeon apical évite le développement des bourgeons axillaires et donc maintient la dominance apicale exercée par le bourgeon apical. A partir de cette expérience, on peut déduire que le bourgeon apical exerce sa dominance par l'intermédiaire de l'auxine. Le bourgeon terminal secrète de l'auxine. Celle-ci circule vers le bas et inhibe le développement des bourgeons axillaires. La concentration d'auxine diminuant progressivement, l'inhibition s'exerce seulement sur une partie plus ou moins grande de la tige, variable selon les plantes.

L'utilisation de mutants auxotrophes pour le tryptophane, possède une dominance apicale faible ce qui conduit à un développement des bourgeons axillaires. La synthèse en auxine étant faible, le bourgeon apical ne peut exercer une inhibition.

  • Développement des fruits:

L'auxine stimule les divisions de l'ovaire.

L'auxine stimule la croissance des fruits.

expérience de Nitsch en 1950:

Si on supprime les akènes (vrais fruits) pendant la croissance de la fraise le faux-fruit (réceptacle floral) se développe peu, j'ai une inhibition de sa croissance.

Si on supprime les akènes d'un coté de la fraise et qu'on les laisse de l'autre coté, la fraise se développe de manière asymétrique. Plus fort développement du coté présentant encore des akènes.

Si on supprime tous les akènes de la fraise et qu'on applique de l'auxine sur le receptacle floral, la croissance de la fraise est normale.L’application d’auxine rétablit le développement de la fraise privée d’akène.

Si on applique de l'auxine sur le fruit en fin de croissance, le fruit murît: c'est la senescence du fruit. On stimule la synthèse d'éthyléne qui permet le murissement.

nitsch

  • Abscission (chute) des feuilles et des fruits:

Dans la partie basse du pétiole se trouve une zone responsable de la chute des feuilles appelée zone génératrice. Les cellules de celle-ci se dédifférencient et entrent en mitose, on obtient une sorte de méristéme où les cellules ont des parois fragiles: c'est la zone de rupture. En présence d'auxine, on inhibe la formation de cette zone génératrice, mais en excès,l'auxine stimule la synthèse d'éthylène et donc favorise la formation de cette zone.

  • Stress abiotique (stress du à l'environnement):

Exemples de stress:

O3 (ozone); UV; déficite hydrique.

En stress hydrique, la plante ferme ses stomates au niveau de l'épiderme des feuilles. La plante produit l'acide abscissique qui déclenche la fermeture des stomates. Les auxines ont l'effet opposé. Elles stimulent l'ouverture des stomates.

 

Lire la suite

Le transfert horizontal chez les bactéries

8 Août 2011 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Definition:


Le transfert horizontal de gènes est un processus dans lequel un organisme intégre du matériel génètique provenant d'un autre organisme sans en être le descendant. Chez les bactéries, le transfert horizontal joue un rôle majeur dans leur diversification. Ce processus est considéré comme un des facteurs principaux de l'augmentation de la résistance des bactéries aux antibiotiques ainsi que la propagation des gènes de virulence.

 

Histoire:

 

 

  Michael Syvanen était parmi les premiers biologistes occidentaux pour explorer la signification potentielle du transfert transversal de gène. Syvanen a édité une série de publications sur le transfert horizontal de gène commençant en 1984, prévoyant que le transfert transversal de gène est un processus qui a formé l'histoire évolutionnaire dès le début de la vie sur terre.

 

Mécanismes  de transfert horizontal:

 

3 mécanismes en découlent:

 

La conjugaison bactérienne: elle consiste en une transmission de plasmides de conjugaison d'une bactérie donneuse à une bactérie receveuse . La bactérie donneuse posséde le plasmide facteur F, codant pour 24 gènes dont les protéines pilines constitutives des pili. Le facteur F est un épisome, car il peut s'intégrer dans le génome bactérien (souches Hfr).
  Lors de la conjugaison, la bactérie  donneuse (F+) ou Hfr va synthétiser des pili, qui vont lui permettre de s'arrimer à une bactérie receveuse ( F-).
  Le plasmide F va ensuite étre répliqué sous forme de simple brin, et la copie transférée vers la bactérie F- "reçeveuse". Comment a lieu ce transfert ? Longtemps considéré comme un canal de transfert, le pili serait maintenant vu comme une premiére étape d'arrimage, avant que les deux bactéries ne se rapprochent et que le transfert s'effectue par accolement des membranes.
  Lorsque l'épisome est inclu dans le génôme (souches Hfr), une partie du génôme bactérien est copié et transféré à la bactérie reçeveuse. Théoriquement, une copie totale du génôme devrait étre ainsi transférée. Mais ceci reste théorique, car la conjugaison n'est pas maintenue assez longtemps pour celà. Les gènes ont une probabilité de copie et de transfert plus forte s'ils sont situés à proximité de l'épisome.
  L'ADN simple brin transféré est ensuite transformé en double brin. Un double crossing-over permet d'intégrer les exogénes homologues dans le génôme de la bactérie reçeveuse. L'ADN exogéne linéaire après cet épisode ne peut se maintenir dans la bactérie, et finira par étre dégradée.
  La bactérie reçeveuse est devenue recombinante et a intégré des exogénes dans son génôme ou dans le plasmide F 

 

Les gènes codés par les plasmides de conjugaison confèrent diverses propriétés biologiques aux bactéries : résistance aux antibiotiques, résistance aux antiseptiques, résistance aux métaux lourds, résistance aux bactériophages, acquisition de facteurs de pathogénicité, acquisition de nouvelles propriétés métaboliques, synthèse de bactériocines etc.
Les plasmides de conjugaison (et les gènes portés par ces plasmides) peuvent se transmettre entre bactéries d'une même espèce, mais aussi entre bactéries d'espèces différentes.

 

 

Intérêt:

La conjugaison a permis d'étudier le groupe de liaison entre les gènes (linkage) et de dresser la carte génétique des bactéries.

 

  La transduction est un mécanisme lié aux bactériophages (virus spécifiques des bactéries): en effet, ces virus sont capables d'injecter leur génôme dans la bactérie pour qu'elle le réplique et le traduise. Selon les bactériophages, la transduction est un phénomène généralisé (n'importe quel gène est susceptible d'être transféré à une bactérie réceptrice) ou localisée (le transfert ne concerne que quelques gènes dont la nature est variable selon le bactériophage). Elle produit alors des particules virales, les copies du génôme sont encapsidées et la bactérie est lysée, laissant s'échapper les particules virales. On parle alors de cycle lytique.
  Mais le phage peut être tempéré, et suivre un cycle lysogénique. Dans ce cas l'ADN virale est injectée dans la bactérie et s'insére dans le génôme bactérien. Puis, suivant les conditions, l'ADN sera extrudé du génôme et engagera un cycle lytique.
  Lors de la lyse cellulaire, l'ADN génomique est morcellée, et il arrive que des fragments d'ADN soient encapsidés dans des capsides virales. On obtient alors un phage recombinant, qui, s'il infecte une nouvelle bactérie, ne créra pas de cycle viral, mais permettra une recombinaison homologue par exemple. Des génes peuvent ainsi être transférés de bactéries à bactéries via des phages communs.


  La transformation est un évènement assez mal expliqué. Il arrive que les bactéries incorporent de l'ADN et effectuent un événement de recombinaison. Dans d'autres cas, comme lors des applications biotechnologiques, on force la bactérie à incorporer un ADN plasmidique par électroporation. Les bactéries ainsi transformées pourront exprimer les gènes présents sur le plasmide.

 

Lire la suite

La spectrométrie de masse

5 Octobre 2010 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

 

Mass Spectrometry ou MS est une technique physique d'analyse permettant de détecter et d'identifier des molécules d'intérêt par mesure de leur masse et de caractériser leur structure chimique

 

Histoire:

  • En 1910, le britanique Joseph John Thomson  conçoit la technique de spectrométrie de masse et met en évidence l'existence d'isotopes stables du néon.
  • En 1918, Arthur Jeffrey Dempster construit un spectrométre de masse à secteur magnétique.
  • En 1942, commercialisation du premier appareil.
  • En 1949, Herzog et Viehbok élaborent la spectrométrie de masse à ionisation secondaire connu sous le nom de SIMS (Secondary Ion Mass spectromtry).
  • En 1959, Roland Gohlke réalise le premier couplage de la chromatographie en phase gazeuse avec la spectromètrie de masse CG-SM.
  • En 1980, le thermospray.
  • En 1981, mise en place d'une technique de ionisation par bombardement d'atomes rapides connu sous le nom de FAB.
  • En 1985, Hillenkamp découvre  le MALDI (matrix-assisted-laser-desorption-ionization) qui permet d'effectuer le  séquençage de peptides.
  • En 1988, Fenn découvre la méthode d'ionisation électrospray qui permet les mesures de hautes masses moléculaires de peptides.

 

Principe:

Un composé organique introduit dans le spectromètre de masse est ionisé par bombardement électronique à 70eV. L'ion ainsi obtenu , appelé ion moléculaire, permet la détermination de la masse molaire du composé. Il peut y avoir des ruptures des liaisons chimiques au sein de l'ion moléculaire, formant ainsi des ions fragments caractéristiques puisque cette dissociation éventuelle ne se fait pas au hasard mais selon des mécanismes bien déterminés. Ces ions fragments sont ensuite séparés en fonction de leur rapport masse/charge par l'application d'un champ magnétique et/ou électronique, puis collectés par un détecteur. L'ensemble des ces ions fragments constitue le spectre de masse dont la lecture permet l'identification de la structure moléculaire.

 

La composition de base d'un spectromètre de masse: 

  • Un système d'introduction de l'échantillon
  • Une source d'ions ou chambre d'ionisation
  • Un analyseur qui sépare les ions en fonction de leur masse et de leur charge
  • Un détecteur qui détecte les ions sortant de l'analyseur

 

 spectrométre de masse

  Chacun de ces élèments étant dans les conditions de vide. 

  • La première étape consiste à:

introduire l'échantillon dans la source d'ion. Cette introduction dépendra de l'état physique de l'échantillon (gaz, solide ou liquide).

  1. Pour les gaz et les liquides volatils, l'introduction s'effectue a l'aide d'un ballon chauffé mis en relation avec la source d'ion.
  2. Pour les solides, on utilisera une canne d'introduction possédant un filamment sur lequel on déposera l'échantillon préalablement dissout dans un solvant organique. L'échantillon peut être également introduit par un système séparatif comme la chromatographie en phase gazeuse, liquide, ou électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse.
  • La deuxième étape consiste à:

vaporiser les molécules et à les ioniser. Une source d'ionisation peut être utilisée soit en mode positif pour étudier les ions positifs, soit en mode négatif pour étudier les ions négatifs. Plusieurs type de sources existent et sont utilisées en fonction du résultat recherché et des molécules analysées. 

 

  • L'impact électronique (EI-MS) consiste à obtenir, sous vide , l'interaction d'une molécule et d'un électron accéléré à quelques dizaines de volts. 
  • La ionisation chimique (CI-MS)  est une méthode qui utilise un gaz réactif (à la pression d'environ 1 mm Hg) qui est ionisé par un faisceau d'électrons et donne une série d'ions qui à leur tour réagissent avec les substances à analyser. On peut utiliser divers gaz, parmi lesquels l'ammoniac, le méthane et l'isobutane. 
  • L'electrospray est une technique qui permet de désolvater et d'ioniser, sous pression atmosphérique, les molécules d'échantillons dissoutes dans un solvant sous l'influence d'un champ électrique. 
  • La spectrométrie de masse à ions secondaires avec cible liquide (L.S.I.M.S) est une technique de désorption-ionisation par des ions rapides (Cs+ accélérés à 30kV) en présence d'une matrice liquides. 
  • Le bombardement par atomes rapides (F.A.B) est une technique dont le matériau à analyser est dissou dans une matrice liquide puis bombardé sous vide avec une énergie élevée par un faisceau d'atomes. 
  • La désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est une technique permettant de ioniser un échantillon solide préalablement dispersé dans une grande quantité de matrice en l'irradiant par des photons émis par un laser dont la longueur d'onde est située dans la bande d'absorption de la matrice.


  • La troisième étape consiste à l'analyse: 

L'analyseur quadripolaire est constitués de 4 barres parallèles ayant idéalement une section hyperbolique, disposées symétriquement autour d'un axe. Ces 4 barres sont associées électriquement 2 par 2 et  créant ainsi un champ électrique d'oscillation laissant passer certaines masses tandis que d'autres sont sur une trajectoire instable ne leur permettant pas d'atteindre le détecteur. Le quadripôle est donc un filtre de masse.

  L'analyseur quadripolaire

 

 

L'analyseur à piégeage d'ions est un quadripôle à 3 dimensions constitué d'une électrode annulaire et de 2 électrodes "chapeaux" de sections hyperbolique. Le mouvement des ions en 3 dimensions à l'intérieur du piège dépend de la masse m de l'ion, ainsi que de sa charge Z. Il existe des zones de stabilité dans lesquelles des ions de masse m peuvent avoir un mouvement vibratoire stable et donc rester piégés dans la trappe ionique. Les ions sont d'abord tous piégés à l'intérieur de la trappe, confinés dans une certaine gamme de masse puis éjectés sélectivement en direction du détecteur. Le spectre de masse est obtenu en augmentant progressivement la tension pour destabiliser les trajectoires des ions en fonction de leurs masses croissantes.

trappe ionique

 

L'analyseur à temps de vol (time-of-flight, TOF-MS) est un système qui utilise la désintégration d'atomes de 252Cf  (isotope de californium qui est un puissant émetteur de neutrons ce qui le rend particulièrement dangereux. Chaque microgramme de 252Cf émet spontanément 2 314 000 neutrons par seconde) qui peuvent dans 3% des cas se désintégrer en deux particules Tc (Technétium) et Ba (Baryum) émises simultanément et dans deux directions opposées. L'une des deux est immédiatement détectée et donne un signal de départ, tandis que l'autre frappe une "cible" sur laquelle est déposé l'échantillon. Celui-ci va alors émettre de 1 à 10 ions secondaires, qui vont se déplacer à une vitesse inversement proportionnelle à la racine carrée de leur masse. Le temps qu'ils mettent pour atteindre le détecteur (= leur temps de vol) permet donc de déterminer la masse des ions.

  • Avantage: 

Cet analyseur offre la possibilité unique de détecter la présence simultanée d'un grand nombre de composés en mélange.

  • Limites:

La transmission, l'efficacité de détection décroît avec la vitesse pour les ions de haut poids moléculaire.
Cet technique nécessite de disposer d'un mode de production des ions impulsionnel afin de déclencher la mesure des temps de vol.

 

Les avantages de la spectrométrie de masse:

  • Sa versatilité
  • Sa sensibilité
  • Sa capacité à être couplée aux techniques séparatives

Les inconvénients de la spectrométrie de masse:

 

La mesure de masse ne peut être effectuée que sur la molécule isolée, il est donc nécessaire de transformer un échantillon généralement liquide ou solide en gaz dilué nécessitant un vide poussé.

 

Secteurs professionnels utilisant cette technique:

  • Hôpitaux
  • Musée (permet de mettre en évidence la présence d'huiles, de cires, de résines terpéniques, de gommes polysaccharidiques et de colles animales, à partir de micro-prélèvements effectués sur des œuvres d'art).
  • Aéroports
  • Laboratoires
  • Polices scientifiques
  • Archéométrie (datations; analyses élèmentaires et isotopiques; identifications de matériaux organiques complexes).

Son utilisation:

 

  • Identification :
    • Suivant le type d'ionisation utilisé, un spectre de masse peut être caractéristique d'une molécule. Ainsi en le comparant avec des banques de spectres, il est possible d'identifier la molécule.
    • Lors de l'utilisation d'un analyseur haute résolution (TOF, secteur magnétique, FTICR, Orbitrap), la spectrométrie de masse permet de mesurer avec précision la masse monoisotopique d'un ion et d'en déduire sa formule brute.
  • Analyse structurale :
    • La parité de la masse mesurée est fonction de la parité du nombre d’atomes d’azote que possède une molécule (règle de l’azote).

       

    • Chaque atome possède un ou plusieurs isotopes qui sont de masses différentes par définition. Ainsi, la proportion de chaque isotope observé sur un spectre de masse, c'est-à-dire le massif isotopique, est caractéristique de la présence de certains atomes et de leur nombre dans l'ion mesuré (en particulier: Cl, Br, qui présentent des isotopes M et M+2 en quantité notable).
    • Les ions peuvent se fragmenter dans un spectromètre de masse : dans la source d'ionisation, dans l'analyseur ou dans une cellule de collision. Comme les fragmentations respectent des lois précises de chimie en phase gazeuse, l'étude de ces fragments permet de déterminer la structure des ions.
  • Quantification :
    • Un spectromètre de masse est un détecteur universel et très sensible. Sa gamme linéaire va de 3 à 7 ordres de grandeur, d'où la possibilité d'obtenir une quantification fiable sur un domaine large.

 

 

Lire la suite

le test des comètes

22 Février 2010 , Rédigé par par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

histoire:

Cette technique fut mise au point en 1984 par Osting O et Johanson K dans le but de détecter les cassures doubles brins de l'ADN. La lyse et l'électrophorèse fut effectuées dans des conditions neutres et la coloration avec de l'acridine orange (l'acridine se lie à l'ADN et à l'ARN grâce à ses propriétés d'intercalation).
Elle fut ensuite optimisée par Singh et all en 1988 afin de détecter les cassures simples brins et les sites alcali-labiles. L'électrophorèse, dans ce cas présent, se réalise dans des conditions fortement alcalines afin de relaxer et de détendre l'ADN superenroulé.


Principe:

Le test des comètes ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) est une technique d'électrophorèse sur microgel d'agarose. Il permet de mesurer les cassures induites directement par un agent génotoxique et indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de fragmentation de l'ADN tel que l'apoptose.

Mode opératoire:

Les cellules après un contact avec un agent altérant la structure de l'ADN (isotopes, agents oxydants ou autres molécules toxiques) pendant un temps donné sont décollées de leur boite de pétri pour y être englobées dans un gel d'agarose et déposées sur une lame de microscope. Elles sont ensuites soumises à l'action d'un agent alcalin (pH 10)  qui a pour effet de lyser les cellules (destruction  des membranes, des protéines et des ARNs) et de libérer les noyaux. Ces derniers sont ensuite incubés dans un tampon d'électrophorèse  basique (pH 13) pour faciliter la dénaturation, la détorsion de l'hélice et l'exposition des sites sensibles aux agents alcalins. L'ADN ainsi relaché,  est soumis à une électrophorèse (de faible voltage et ampérage) puis révélé par addition d'un intercalant fluorescent (le Bromure d'éthydium).
Si l'ADN n'a pas été  endommagé (reste sous forme super enroulé) sera révélé sous forme d'une sphère compacte.
Si l'ADN a été endommagé, celui-ci présentera en plus des fragments simples et doubles brins (plus légers) qui migreront en dehors de cette sphère formant un "halo" d'ADN qui s'étirent en direction de l'anode et décrivent la queue de la comète.
test des comètes
avantages:

  • Cette technique permet de quantifier d'une part les dommages causés à l'ADN par divers agents toxiques et d'autre part la réparation des dommages dans les cellules eucaryotes ainsi  que dans quelques cellules procaryotes in vivo et in vitro.
  • Technique non invasive.
  • Technique sensible (détection d'environ  0,2 à 2 coupures par 109 daltons).
  • Les résultats sont obtenus en quelques heures  par rapport aux techniques conventionnelles.
  • 50 à 100 cellules sont comptées par échantillon par comptage manuel ou en utilisant un logiciel.

inconvénients:

  • Le débit de cette technique est bas, car une électrophorèse correspond à un type cellulaire / un agent toxique / une concentration.
  • Les résultats ne peuvent être comparés que s'ils proviennent d'électrophorèses réalisées ensembles.
Exemples d'application:

  • Evaluation des produits chimiques génotoxiques in vivo et in vitro.
  • Etude sur la réparation de l'ADN (réparation par excision; Strand Break Repair).
  • Etude sur les dommages causés à l'ADN (cassure simple brin; sites alcali-labile; réticulation de l'ADN).
  • En éco-toxicologie: test utilisé pour surveiller des sols et étudier la toxicologie aquatique.
  • Evaluation des polluants génotoxiques provenant de sites de déchets dangereux.
  • Epidémiologie de l'homme:
    • Banque de sang.
    • Suivi de la radio et chimio-thérapie chez les patients cancéreux.
    • Banque de sperme.
Lire la suite

Le test d'Ames pour évaluer le pouvoir cancérigène d'une substance

26 Janvier 2010 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:


Ce test biologique  fut décrit en 1973 par Bruce Ames.


Intérêt:


L'apparition d'un cancer est souvent lié à des dommages causés dans l'ADN. Ce test permet d'estimer le potentiel cancérigène d'une substance.


Principe:


Le test d'Ames évalue la facilité qu'une substance induise une réversion dans l'expression des gènes pour l'histidine sur des souches bactériennes mutagènes de Salmonella typhimurium. La mutation rend les bactéries auxotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent se développer que dans un milieu possédant cet acide aminé contrairement aux bactéries sauvages  (prototrophes) qui poussent dans un milieu  qui en est dépourvu. On cherche l'apparition de souches mutantes.

Pour s'assurer que la réplication de l'ADN puisse se faire en présence du mutagène potentiel, les bactéries et la substance analysée sont mélangées dans de l'agar mou auquel on ajoute de faibles quantités d'histidine. Cet agar mou est ensuite étalé à la surface de boîtes d'agar réalisées avec un milieu minimum. Les boîtes sont incubées 2 à 3 jours à 37°C. Les cellules auxotrophes pour l'histidine pousseront quelques heures jusqu'à épuisement de l'histidine du milieu d'agar mou. Seules les révertants, ayant retrouvé la capacité à synthétiser de l'histidine, seront ensuite capables de se développer sur ce milieu minimum. Les colonies sont ensuite dénombrées et la valeur obtenue sera comparée à un témoin afin d'estimer le pouvoir mutagène relatif de la substance vis-à-vis de ces souches auxotrophes pour l'histidine.

test d'ames

Particularité des souches bactériennes:

  • Les bactéries doivent posséder un caractére provoquant la formation de parois dépourvues d'un lipopolysaccharide  rendant les cellules perméables à de nombreuses substances.
  • Les bactéries sont déficientes dans leur système de réparation de l'ADN par excision et possédent des gènes plasmidiques favorisant un fort taux de mutation lors de la réparation de l'ADN.

Particularité du milieu de culture:
Certaines substances nécessitent un inducteur pour être mutagène.
un extrait de foie de rat appelé S9 Mix (fraction microsomale) obtenu par ultracentrifugation est souvent ajouté à l'agar mou avant étalement. Cet extrait enzymatique convertirait les substances cancérogènes en dérivés électrophiles, plus susceptibles de réagir directement avec l'ADN, système absent chez les bactéries mais présent chez les mammifères. Ainsi de nombreux agents cancérogènes comme les aflatoxines ne deviennent actifs dans ce test qu'en présence de cet extrait de foie.

Avantages:

méthode simple, sensible et précise.
Ce test peut également s'appliquer à l'analyse d'effluents industriels, d'eau à usage alimentaire, de fumées ou de gaz d'échappement, de liquides biologiques humains (urines, fécès) provenant d'individus mis en contact par leur travail avec des produits cancérogènes. Les médicaments  et leur principe actif  peuvent aussi faire l'objet d'un examen systèmatique par ce test.

 

Inconvénient:


Ce test utilise des bactéries. Celles-ci ne présentent pas un modèle parfait  pour l'homme.


Lire la suite

La cytométrie en flux (CMF)

16 Novembre 2009 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:

 

En 1934Moldavan, à Montréal, conçut le premier appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires en faisant défiler les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo électrique.

 


En 1945, W Coulter a mis au point un appareil permettant de compter des cellules et de mesurer leur taille par variation de résistivité du courant liquidien.

 


En 1953, Crosland-Taylor utilise un système d'injection de l'échantillon dans un flux laminaire (système décrits par Reynolds en 1883).

 


En 1965, Kamentsky permet une avancée en permettant l'analyse de 2 constituants cellulaires (DNA/protéine).

 


En 1969, Dan villa utilise le laser comme source lumineuse  car il permet une meilleure focalisation du faisceau, une grande puissance d'excitation et une stabilité du chromatisme.

 


Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales.

 

Premier cytométre commercialisés.


Dans les années 80, on peut entreprendre l'analyse de 3 paramètres de fluorescence par cellule.

 


Dans les années 90, on peut entreprendre l'analyse de 7 paramètres de fluorescence par cellule.

 


En 2001, on peut entreprendre l'analyse de 11 paramètres de fluorescence par cellule.

 


En 2006, on peut entreprendre l'analyse de 18 paramètres de fluorescence par cellule.

 


 
Principe:

 

La suspension cellulaire à analyser est injectée sous pression au centre d'une gaine liquide préssurisée. Les cellules vont être contraintes de s'y centrer et vont ainsi traverser individuellement le faisceau laser focalisé sur l'axe du jet. Les méthodes de mesure sont basées sur l'absorption et la diffusion du rayon laser par la cellule, la fluorescence émise par les flurochromes fixés et la forme du signal détecté.


  • La cellule, après interception de la lumière incidente (rayon laser) réemet dans divers directions une partie de la lumière sous forme de signaux représentatifs  de la taille et de la granulosité de la cellule. Il est ainsi possible par exemple de distinguer les lymphocytes, des monocytes et des polynucléaires, de différencier les cellules vivantes des cellules en apoptose et de mettre en évidence la phagocytose.


  • L'émission de fluorescence peut être spontanée mais le plus souvent apporté à la cellule par un ou plusieurs fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée sous forme de photons d’une longueur d’onde plus élevée. Elle permet de renseigner sur les propriétés cellulaires. Il est ainsi possible de réaliser des mesures d'ADN, d'ARN, de protéines, de calcium. Associé à un anticorps ou à un ligand spécifique, le fluorochrome  permet de quantifier et de réaliser une étude fonctionnelle de récepteur à la surface cellulaire.


Les signaux ainsi émis sont focalisés, séparés par une alternance de miroirs et de filtres optiques, en fonction de leur longueur d'onde. Ils sont ensuite amplifiés et transformés en impulsions électriques par les photomultiplicateurs puis digitalisés pour être utilisés par l'unité informatique.

 

La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement des sous populations définies par leurs propriétés optiques à partir d'une population hétérogène.

Le tri cellulaire permet de purifier d'éliminer des cellules mortes d'une culture et de faire du clonage en plaçant une cellule par puits dans une plaque de culture.

 


Avantages:

  • Etude quantitative de nombreuses caractéristiques (présence d'un antigène, quantité d'ADN ou d'ARN, activité enzymatique etc...).
  • Analyses précises sur des critères très différents et très nombreux.
  • Séparation des cellules avec une très grande pureté en condition stérile.
  • N'abime pas les cellules.


Inconvénients:

  • Les cellules doivent être en suspension.
  • Le nombre de cellules doit être de l'ordre de quelques centaines de milliers au minimum.
  • Pas d'image des cellules analysées.
  • L'analyse étant qu'à un unique instant donné, on ne peut pas faire de véritable étude cinétique portant sur une même cellule.


Principaux secteurs utilisant cette technologie:

Hématologie
Cancérologie
Immunologie
Pharmacologie
Océanographie
Physiologie végétale

  Intérêts d'application:

  • Analyse de constituants ou compartiments cellulaire: ADN, ARN, protéines, expression d'antigénes (membranaires ou intracellulaires), enzymes, hormones.
  • Analyse d'activités cellulaire (modification du pH, du Ca2+), métabolisme oxydatif, potentiel membranaire.


Lire la suite
1 2 3 > >>