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biotechnologie

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microbiologie

10 Juillet 2007 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

La microbiologie et ces applications en biotechnologie.

  • Histoire:

l'observation des microbes n'a pu se faire qu'a partir d'une avancée technique importante : le MICROSCOPE. En 1680 Anton Van Leeuwenhoeck inventa le premier microscope optique lui permettant les premières observations (avec un grossissement de 100 fois environ) des micro-organismes , appelés à l'époque "animalcules". Jusqu'en 1857, les scientifiques croyaient que les "animalcules" provenaient de la transformation spontanée de la matière organique.

Louis Pasteur réfute l'idée de la génération spontanée. Il appuie sa théorie en prenant comme expérience la transformation du lait, des céréales et jus de fruit. Cette transformation n'est possible que par un ensemencement naturel venant de l'extérieur. Et ces organismes microscopiques seront appelés les ferments. Il utilisera pour cela un récipient clos contenant la solution qu'il portera à ébullition afin de détruire tous les microorganismes présents dans celle-ci. 

  • Les micro-organismes des usines à tout faire:

La manipulation de la potentialité naturelle des bactéries afin de les améliorer soit métaboliquement en modifiant leur milieu naturel soit génétiquement en modifiant le génome.

 

 

 Ecoli incubated at 50 degrees
(
http://www.flickr.com/photos/mooneyes/514363259/)

  


En 1985
: transformation bactérienne possédant le gène humain de l'insuline.

En 1986 :fabrication de l'interféron par des bactéries (fabriqué dans l'organisme à faible dose, il agit à fort dose contre certain cancer).

En 1987 premier vaccin recombinant: la réalisation de ce vaccin consiste à injecter le gène qui code pour l'épitope de la virulence provenant d'une batérie pathogène à une bactérie non pathogène et de l'administrer à l'organisme qui devant sa présence, synthétisera l'anticorps correspondant à cette bactérie pathogène. Un épitope est un déterminant antigénique, c'est à dire une partie d'une molécule reconnue comme étrangère par le système immunitaire... Si un antigène est une protéine par exemple, l'épitope sera la séquence de quelques acides aminés reconnue comme étrangère.

 En 1989: synthèse de l'érythropoïétine par génie génétique (hormone qui provoque l'augmentation de globules rouges dans le sang).

  • La microbiologie et ses applications en génie génétique:

l'objectif du génie génétique:

 Le génie génétique est un ensemble de techniques, issues de la biotechnologie, ayant pour objet la modification des génotypes, et donc des phénotypes, par transgénèse. Cette manipulation permet aux cellules receveuses d'acquérir de nouvelles propriétés provenant d'une espèce différente. il consiste à transférer un gène d'une espèce à une autre.

Une des étapes importantes dans le transfert de gène consiste à obtenir des clones c'est à dire isoler et multiplier le gène d'intérêt. Cette étape necessite l'utilisation de bactéries afin d'en assurer leurs transformations, c'est à dire à l'introduction de fragments d'ADN dans celles-ci par l'intermédiaire de vecteurs de clonage. Les vecteurs sont des petits ADN dans lesquels on insère un fragment d'ADN que l'on veut étudier. Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages. Pour assurer cette transformation, le choix de la souche bactérienne est très importante: Les bactéries ne doivent pas être hermétique à l'introduction de vecteurs de clonage. Elles doivent posséder une mutation pour le gène qui code pour une protéase. 

 La transformation des bactéries peut se faire par 2 méthodes :

Les bactéries et les vecteurs de clonage sont plongées dans une solution de chlorure de calcium. Ce sel de calcium agit sur la paroi des bactéries en créant des orifices. On fait subir dans le même temps un choc thermique en plaçant l'ensemble sur de la glace afin de permettre au plasmide d'entrer en contact avec la paroi puis un retour à une température de 37°C afin d'assurer l'introdution de celui-ci dans la bactérie.

 La technique d'électroporation consiste à placer les bactéries en solution à des impulsions électriques provoquant des pores à travers la paroi et ainsi permettre l'entrée des plasmides.


Exemple d'utilisation de bactéries transformées en vue d'une utilisation médicale:

Une collaboration de l'équipe de Michel Guérineau de l'Institut de Génétique et de Microbiologie (CNRS-université Paris 11) et la société Rhône-Poulenc-Rorer, dans le cadre du programme Bioavenir, ont abouti en 1997 à la construction d'une souche bactérienne génétiquement modifiée de Streptomyces pristinaespiralis produisant un antibiotique, la pristinamycine. La pristinamycine produit normalement par la bactérie est constituée d'un mélange de 2 composants: la pristinamycine I et la pristinamycine II. Cette dernière est elle-même un mélange de 2 molécules: la PIIA qui est le produit final de la voie de biosynthèse et la PIIB qui est le précurseur de la PIIA. Cependant la souche naturelle était incapable d'assurer la bioconversation totale de PIIB vers PIIA, d'ou la necessité de transformer cette souche par génie génétique en y introduisant les gènes codant pour la PIIA synthétase. Les souches possédant ce gène pourront ainsi fabriquer l'enzyme qui assurera la bioconversion de PIIB en PIIA.


Exemple: la modification génétique des bactéries lactiques en vue de leurs utilisations dans la transformation alimentaire
.

 Même si à ce jour, il n'y a pas encore de bactéries lactiques transgéniques autorisées dans les aliments, leurs utilisations pourraient apporter des solutions à de nombreux problèmes que rencontre les industries agroalimentaires lors des procédés de fabrications. Ces bactéries pourraient être une réponse aux attaques de bactériophages (virus s'attaquant au bactéries) qui peuvent mettre en echec la fermentation et ainsi diminuer la qualité du produit voir même, si la contamination est importante, détruire la production. On peut bien imaginer les conséquences économiques et sanitaire que cela peut engendrer. Les bactéries lactiques produisent une grande variété de peptides ou de protéines ayant une activité antibactérienne. Ces molécules appelées bactériocines peuvent être une solution dans la sécurité hygiènique de certains fromages. l'utilisation de souches transgéniques deviendraient encore plus efficaces car plus spécifiques vis-à-vis des bactéries cibles. La modification de la structure des bactériocines permettraient également de les rendre moins sensibles aux milieux. La forme sauvage étant moins efficaces dans le fromage que la forme modifiée. L'obtention reproductible du produit est rendu plus difficile d'une part par l'utilisation d'une matière première "comme le lait" très variable en ses élèments imfluançant l'efficacité du système métabolique des bactéries et d'autre part, les souches sauvages présentent une instabilité génétique en particulier pour les caractères impliqués dans l'utilisation de leur source d'énergie glucidique ou des fractions azotées impliquées dans la synthèse de leurs protéines. Modifier génétiquement la régulation des systèmes métaboliques de ces souches permettrait de les rendre moins dépendant de ces variations de milieux de cultures et génétiques.


Exemple: l'utilisation des microorganismes transgéniques en vue d'une application environnementale et industrielle.

La présence de matières toxiques ou dangereuses conduit au développement de certaines bactéries qui les utilisent dans leur métabolisme qui les convertit en produits inoffensifs. Cette observation a amené certains chercheurs à les utiliser pour décontaminer des zones polluées. Ce procédé, appelé la biorestauration, fût expérimenté lors du naufrage du pétrolier Exxon Valdez en 1989 le long des côtes d'Alaska. Actuellement des études sont menées pour perfectionner cette technique en utilisant des bactéries transgéniques, notamment par des groupes de chercheurs en Microbiologie environnementale et Bioingénierie environnementale de l'IRB-CNRC et l'Institut Française du pétrole dont leur étude repose sur l'utilisation de bactéries transgéniques capablent de dégrader le méthyl-tertiobutyl éther (MTBE) dans les eaux souterraines. le MTBE est un additif de l'essence qui contribue à réduire les émissions de monoxyde de carbone et d'hydrocarbures imbrulés. En raison de sa grande solubilité dans l'eau et de la fréquence élevée des déversements, le MTBE contamine de nombreux aquifères.Un groupe de gènes permettant au Mycobacterium austroafricanum d'utiliser le MTBE comme seule source de carbone à pu être isolé et cloné dans une bactérie hétérologue (Mycobacterium smegmatis) afin de confirmer leur rôle.

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OGM

31 Janvier 2007 , Rédigé par Magniez Publié dans #biotechnologies

finition:

Un OGM désigne un organisme vivant dont le patrimoine génétique a été modifié par l'introduction d'un  ou plusieurs gènes étrangers à son espèces. Cette manipulation génétique, effectuée en laboratoire porte le nom de trangénèse. Tous les êtres vivants sont concernés : bactéries, virus, plantes et animaux. Cette modification à pour intérêt d'apporter un ou plusieurs caractères que ne possédés pas l'espèce. (En terme scientifique, les caractères d'un individu sont appelés des phénotypes).

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Les biotechnologies végétales pour quoi faire?

25 Janvier 2007 , Rédigé par Magniez Publié dans #biotechnologies

Les biotechnologies végétales pour quoi faire?

L'introduction et l'utilisation des biotechnologies végétales sont étroitement liées à l'évolution de l'amélioration des plantes en tant que science.

Les objectifs de la sélection variétale sont:

Plus de productivité; plus de résistances aux maladies et aux pathogènes; Meilleures adaptations aux sols et aux climats; Meilleures adaptations aux techniques culturales; régularité de productivité et de forme; meilleures qualités culinaires et adaptation aux process de transformation industrielle.

La sélection classique:

La création de nouvelles variétés végétales possédant un ou de nouveaux caractères nécessite la maîtrise de la reproduction sexuée par des croisements contrôlés (en veillant à  distinguer les plantes allogames; autogames  ou hermaphrodites), les étapes successives de sélection (méthode de sélection généalogique ou pédigree) ainsi les recombinaisons génétiques (crossing-over) qui ont lieu lors des croisements

les plantes allogames sont des plantes qui préfèrent être pollinisées par un pollen différent .Les Plantes autogames préfèrent le mariage avec eux-même.

La sélection classique par le fait qu'elle repose entièrement sur processus de reproduction sexuée des plantes présente certaines limites qui peuvent être surmontées par les biotechnologies notamment la difficulté de réaliser des croisements interspécifiques entre espèces ainsi que le risque d'introduire lors de la sélection des caractères indésirables.Les biotechnologies permettent de dépasser la barrière de l'espèce mais également de maîtriser avec précision le ou les gènes nouvellement introduits et ceci par l'utilisation d'une technique couramment utilisée qui est la PCR (polymérase chain reaction).

La création d'une nouvelle variété étant directement liée au cycle de végétation et au nombre de génération successive, nécessite un délai très important avant d'être mis sur le marché.L'usage des biotechnologies réduit considérablement ce délai.

Biotechnologies végétales:

Les biotechnologies peuvent intervenir à plusieurs niveaux dans la plante:

  • Au niveau cellulaire par l'utilisation des techniques d'hybridation somatique,d'haplodiploïdisation, multiplication in vitro etc...  ( certaines  de ces techniques seront traitées ultérieurement)
    •  L'utilisation des biotechnologies cellulaires est étroitement liée aux propriétés de la cellule végétale qui sont:
      •  la plasticité des cellules végétales ( adaptation rapide aux variations de l'environnement).
      • La totipotence des cellules (aptitude à la dédifférenciation ) qui permet aux cellules végétales prélevées sur un organe quelconque d'une plante et mise en culture in vitro de régénérer un individu complet et identique à la plante mêre.
  • Au niveau moléculaire par la création d'une carte génétique, l'identification des gènes d'intérêts par le biais de sondes moléculaires.
  • Hybridation des plantes par l'outil des biotechnologies appelé également la transgénèse.

Les biotechnologies cellulaires:

Les biotechnologies cellulaires permettent d'exploiter la diversité génétique existante de l'espèce et entre les espèces et d'introduction cette diversité  par mutagénèse; la technique de sauvetage d'embryon interspécifique; la fusion de protoplates et la variation somaclonale.

Principe de la technique du Sauvetage d'embryon interspécifique:

Si on croise une espèce sauvage de tomate avec une espèce cultivée de tomate, l'embryon issu de cette fécondation va avorter à cause de l'absence d'appariement des chromosomes lors de la prophase I de la méïose (synapsis). Pour éviter cette avortement, l'embryon immature sera prélevè et mise en culture dans une boite de pétri afin d'assurer la régénération d'un nouvel individu possèdant les caractèristiques des 2 espèces.



Principe de la technique d'hybridation somatique:

L'hybridation somatique consiste à fusionner des protoplastes de cellules (cellules végétales dont la paroi a été hydrolysée) d'espèces apparentées afin d'obtenir des plantes génétiquement transformée possèdant de nouveaux caractères agronomiques.

 

En théorie, la fusion permet d’obtenir toutes les combinaisons. Dans la réalité, de nombreuses régulations ont lieu au moment de la première mitose, rendant impossibles certaines combinaisons. De plus, ce n’est pas parce qu’il y a fusion qu’il y a addition des noyaux et des cytoplasmes. Il se produit des éliminations de matériel, dont les mécanismes sont inconnus.

Avec l’hybridation sexuée, entre deux espèces végétales voisines, deux compartiments génétiques ne seront pas exprimés dans l’hybride : les plastes et les mitochondries, qui sont hérités par la mère. Avec l’hybridation somatique, en fusionnant deux protoplastes d’espèces différentes, plus ou moins proches, les deux cytoplasmes peuvent s’exprimer dans la cellule obtenue, c'est-à-dire confronter les génomes chloroplastiques et mitochondriaux. Une variation génétique inaccessible par les voies classiques est alors disponible. Or de nombreuses résistances(comme la résistance aux herbicides) sont d’origine chloroplastique ou mitochondriale, donc difficilement transférables par les voies classiques. A l’aide de l’hybridation somatique, des résistances contenues dans les espèces sauvages ont pu être introduites dans une souche cultivée.


Principe de la technique d'haplodiploïdisation:

L'haplodiploïdisation consiste à obtenir des plantes à partir des gamètes mâles (microspores) ou des gamêtes femelles (sac embryonnaire). La technique utilisant les gamètes mâles porte le nom d'androgenèse, celle utilisant les gamètes femelle porte le nom de gynogenèse.

Après extraction des microspores polliniques , ceux-ci sont placés en culture in vitro afin de favoriser la multiplication cellulaire et la différenciation de celle-ci. La plante obtenue est haploïde c'est à dire qu'elle possède qu'un seul exemplaire de chromosome. Il faut alors procéder à la duplication du nombre de chromosomes par l'utilisation de colchicine (alcaloïde très toxique). A l'issue de ces différentes étapes, on obtient une lignées pures.

Cette technique à un grand avantage pour les selectionneurs. Elle permet de fixer les caractères d'une espèce durablement et de manière très rapide. Si on compare le temps qu'il faut entre le moment où l'on réalise le premier croisement de départ  et la 2ième année d'inscription, il faudra 9 à 10 ans pour créer une variété par le cycle de sélection classique et 6 à 7 ans par le cycle de sélection avec haplodipoïdisation. Il n'est pas nécessaire de procéder à des cycles d'autofécondations répétitifs comme dans la sélection généalogique.

Les biotechnologies moléculaires:

Les sociétés semencières se dirigent vers cette technique, afin d'étudier le polymorphisme des espèces végétales. Cette technique fait appel à des marqueurs moléculaires. Elle a pour avantage de distinguer deux individus très proches dont l'étude phénotypique classique ne le permet pas.Le polymorphisme est identifié sur la base de mutations neutres au niveau des séquences nucléotidiques ou de séquences spécifiques d'individus phénotypiquement identique.

Les marqueurs moléculaire peuvent être de 2 types:

Marqueurs biochimiques: ils correspondent à des formes différentes d'une même proteines (allèles/isozymes).

Marqueurs moléculaires: Ils correspondent à des régions du génome ou les séquences d'ADN sont polymorphes. Ces séquences peuvent correspondre à des séquences codantes ( régions transcrites en ARN et traduites en proteines) ou non codantes (régions régulatrices de la transcriptions).

     

Quelques précautions sont à prendre dans le choix des marqueurs moléculaires:

ils doivent être pluriallélique c'est à dire qu'ils possédent de nombreux alléles permettant de caractériser différents individus. Ces alléles me doivent pas avoir d'effet phénotypique . Les marqueurs doivent être codominants permettant ainsi de distinguer des individus hétérozygotes de ceux  qui sont homozygotes car ils présentent silmultanément les caractères des deux parents. Ils doivent être également indépendant des conditions de culture.

 Exemple d'un marqueur moléculaire RFLD (restriction fragment lingth polymorphism) et la technique southern blot:

Le marqueur RFLD permet de mettre en évidence un polymorphisme allélique correspondant à des mutations fonctionnelles neutres sur l'ADN et donc indécelable au niveau phénotypique. Ces mutations neutres peuvent être des additions, délétions ou substitutions de fragments d'ADN.

Ces mutations vont affecter des régions d'ADN appelées sites de restrictions (Les sites de restriction sont des séquences particulières de nucléotides qui sont reconnues par les enzymes de restriction comme des sites de coupures dans la molécule d'ADN) et ainsi modifier les profils de restrictions après l'analyse southern blot.

Principe de la technique southern blot:

 

 

 

 

 

 

 

 

  

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Présentation des biotechnologies

25 Janvier 2007 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

BIOTECHNOLOGIES
 

La Biotechnologie est une science qui se tourne vers l'utilisation des fonctions biologiques comme outils technologique. Ces fonctions concernent des domaines très différents comme la biologie moléculaire, l'immunologie, la microbiologie, la biochimie, la culture cellulaire ....

 
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Actuellement en plein essor, elle s'adresse à plusieurs activités industrielles: les industries pharmaceutiques, cosmétiques, agro-alimentaires et semenciers. 

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Ce blog présente à la fois l'intérêt d'une telle science mais également ces limites. Quelques techniques utilisées dans les entreprises de biotechnologies sont également présentées.




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mage de cellules gliales par immunofluorescence
 

 

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