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biotechnologie

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La CHROMATOGRAPHIE (2.0)

24 Février 2009 , Rédigé par Mr Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

La chromatographie d'affinité:

Principe:

On utilise une phase stationnaire constituée d'un support macromoléculaire chimique inerte et poreux (dérivés de la carboxyméthylcellulose; gel de polyacrylamide; silice; agarose) sur lequel on a greffé (par covalence) une molécule organique (un effecteur) qui présente une affinité sélective pour certains constituants de l'échantillon à analyser.
Quand une solution protéique non purifiée traverse la colonne, la protéine désirée se lie à l'effecteur, tandis que les autres composants sont élués. La récupération de la protéine désirée est ensuite obtenue par des modifications de la phase mobile. Ces modifications concernent le tampon pH, le tampon de force ionique ou l'ajout d'un compétiteur:

  • le tampon pH différent de celui qui a permis la fixation de la protéine à isoler provoque un changement de l'état d'ionisation de celle-ci provoquant sa désorption.
  • le tampon de force ionique différent de celui qui a permis la fixation de la protéine à isoler provoque un changement de la conformation de la protéine.
  • l'ajout d'un compétiteur (effecteur libre).

L'effecteur:

Selon le type de molécule fixée sur le support, on peut distinguer 3 types d'affinités:

  • l'utilisation comme effecteur un substrat, permet d'entreprendre une sélection d'enzyme.
  • l'utilisation comme effecteur un ligand, permet d'entreprendre une sélection de recepteur.
  • l'utilisation comme effecteur un anticorps, permet d'entreprendre une sélection d'antigène.



La fixation de l'effecteur sur le support d'agarose:

Les groupes hydroxyles (OH) du support d'agarose réagissent avec le bromure de cyanogène pour donner un intermédiaire "activé" et stable (cette manipulation ce réalise à l'aide d'une solution dont le pH est finement contrôlé (pH8,3)), ainsi des groupements imidocarbonate se forment permettant la fixation de l'effecteur contenant des amines libres.
Beaucoup de protéines sont incapables de se fixer à leurs effecteurs couplés  au bromure de cyanogène, a cause d'interférences stériques d'où un problème d'accessibilité avec la matrice d'agarose. On utilise dans ce cas là, un bras espaceur qui se place entre le support et l'effecteur.

Avantage:

La chromatographie d'affinité est la méthode la plus sélective.


Inconvénients:

La chromatographie d'affinité est une méthode coûteuse et délicate à mettre en oeuvre:

- la matrice ne doit pas adsorber.
- la fixation de l'effecteur à la matrice ne doit pas (ou peu) modifier l'affinité de celui-ci vis à vis de la macromolécule cible.
- l'affinité effecteur-macromolécule doit être suffisamment forte pour permettre la fixation, mais pas trop pour que l'on puisse, ensuite, dissocier la liaison et éluer la protéine sans la dénaturer.
- dans le cas d'un isolement d'une enzyme, il est important de veiller à ce que les conditions chromatograhiques ne permettent pas à cette enzyme d'être fonctionnelle, risquant ainsi de transformer l'effecteur.

La chromatographie d'échange d'ions:


Histoire:

C'est en 1951, à l'institut Rockefeller (université de New York) que Stanford Moore et William Stein décrivent la méthode de chromatographie d'échange d'ions en utilisant comme support du polystyrène sulfonaté préalablement équilibré avec une solution de NaOH.
Grâce à cette méthode, lls ont pu déterminer le site actif de la Ribonucléase bien avant que l'on puisse établir sa structure tridimentionnelle. Ils ont ainsi montré que ce site était constitué de 2 résidus spécifiques de l'histidine.

Principe:

Cette méthode repose sur la différence d'interraction entre les molécules chargées à séparer et la phase stationnaire.

La phase stationnaire:

La phase stationnaire est constituée d'un support macromoléculaire chimique comme le dextrane, la cellulose ou le gel de polyacrylamide sur lequel sont greffés par liaison covalente des groupements soient acides, susceptibles de se charger négativement lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH est supérieur à leur pKa . Il s'agit alors d'échangeur de cations.
Soient basiques, susceptibles de se charger positivement lorsque ceux-ci baignent dans une solution tampon dont le pH est inférieur à leur pKa. Il s'agit alors d'échangeur d'anions.


Notons que les groupements d'acide ou de base forte sont ionisés quel que soit le pH de la solution tampon.


Exemple de groupement d'acide faible: le carboxyméthyl au pKa de 4.
Exemple de groupement de base faible: le diethylaminoéthylammonium au pKa de 9,5.
Exemple de groupement d'acide fort: La résine sulfonique.
Exemple de groupement de base forte: l'ammonium quaternaire

L'affinité d'un échangeur pour un ion donné dépend de plusieurs facteurs:

• de la charge des groupements fonctionnels, qui elle-même dépend :

- de leur nature (pKa)
- du pH de la solution

• de la densité de charge de l'ion considéré, qui dépend:

- de la charge de cet ion c'est-à-dire :
- de la nature de l'ion (pKa, pHi)
- du pH de la solution
- de la taille de l'ion (un ion est d'autant plus fixé qu'il est chargé, ou/et qu'il est petit)

• de la concentration des ions
• de l'accessibilité des groupements fonctionnels


La chromatographie d'échange d'ions se réalisent en 4 étapes:

Première étape: la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH  est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé.

Deuxième étape: dépot des molécules à séparer sur la colonne. La solution est dans le même tampon de pH qui a permis de ioniser l'échangeur d'ions.

Troisième étape: élution des molécules fixées sur la résine soit en modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions). Il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine. Soit, en ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine: cet ion s'appelle un contre-ion.


L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant:
  • cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+
  • cations divalents : Cd2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ca2+ 
  • de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca2+ < Al3+
Exemple de contre-ions pour les résines échangeuses d'anions:

Cl- ; HO-


Quatrième étape: régénération de l'échangeur d'ions ( par lavage extensif avec une solution de pH premettant de remettre les charges dans leur valeur initiale).

Les applications de la chromatographie d'échange d'ions :
Cette technique est utilisée pour séparer des molécules ionisables, quelle que soit leur taille comme des ions minéraux, acides aminés, peptides, protéines, nucléotides, acides nucléiques, glucides ionisés et lipides ionisés.

Quelques exemples d'application :

  • l'analyse des eaux usées, des eaux de surface et souterraines
  • la caractérisation de solutions du sol et d'extraits de litières
  • le dosage des anions adsorbés sur la surface des minéraux du sol, en vue de caractériser leur propriétés de charge de surface et leur affinité sélective pour certains ions
  • l'analyse des gaz et eaux d'origine volcanique

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Conduite à tenir en cas d'accident avec du liquide biologique d'origine humaine

12 Février 2009 Publié dans #hygiène et sécurité


Etape 1:


En cas de piqûre ou coupure:
  • Faire saigner,
  • Laver immédiatement et abondamment à l'eau et au savon,
  • Rincer

En cas de projection oculaire:
  • Laver abondamment à l'eau (fontaine oculaire, ou lavabo), 10 minutes minimum.

Etape 2:

Désinfecter et laisser en contact 10 min  (sauf si projection oculaire) avec soit:
  • de l'eau de Javel 12° Chlorométrique diluée (depuis 48h maximum) au 1/10è
  • Une solution de dichloro-isocyanurate de sodium: 1 comprimé pour 1 litre.
  • De l'alcool à 70°.

Etape 3:

  • Prévenir l'ACMO (Agent chargé de la mise en oeuvre des règles d'hygiène et de sécurité) ou une personne du service.
  • Faire décontaminer les surfaces et éliminer tout déchet potentiellement contaminé.

Etape  4:

  • Consulter un médecin dans l'heure qui suit pour: 
    • l'évaluation du risque infectieux,
    • la mise à jour éventuelle des vaccinations,
    • la mise en route éventuelle d'un suivi sérologique.
  • Déclarer l'accident du travail dans les 24 heures.

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La CHROMATOGRAPHIE

6 Février 2009 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies


Historique:

 

 On trouve la première réfèrence d'un processus chromatographique dans l'Ancien Testament qui fait mention de propriétés adsorptives de certaines variétés de bois pour adoucir de l'eau amère. Ce sont les tanins hydrophobes qui constituaient une phase stationnaire apolaire (Chromatographie d'adsorption).


Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Les phénomènes mis en jeu révèlent ici de l'échange d'ions.


En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT inventa la chromatographie par adsorption. Il procéda de la manière suivante: 

Il verse dans une colonne de verre remplie de carbonate de calcium finement pulvérisé un extrait de feuilles vertes à l'éther de pétrole, puis il ajoute une certaine quantité du même solvant pur. Il constate ainsi, que le pigment végétal, d'abord retenu au sommet du récipient, se divise en plusieurs zones en descendant le long de la colonne, à des vitesses différentes, à mesure que le solvant s'écoule au travers du carbonate de calcium, produit adsorbant retenant les substances à sa surface. Ainsi apparaissent successivement une zone jaune pâle d'allure lente, deux zones vertes et trois jaune. Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de chromatographie (du grec Khrôma, couleur et graphein, écrire) définit comme l'enregistrement graphique des couleurs.

  

 



En  1941, Archer John Porter MARTIN et Richard Laurence Millington SYNGE publient la théorie de la chromatographie de partage sur gel de silice
 En 1938, afin d'étudier les acides aminés constituant la laine, ils réalisent des travaux sur la distribution des acétyl-amino-acides entre l'eau et le chloroforme. Ils imaginent ainsi un dispositif d'extraction fractionnée.
  La phase aqueuse est fixée à demeure sur une colonne de gel de silice qui peut retenir de 50 à 100% de son poids d'eau.  Sur cette colonne, il fait traverser une solution des composés à séparer, en l'occurrence des dérivés acétylés d'acides aminés mélangés avec du chloroforme et du butanol.Il réalisent ensuite des extractions successives.


1944 CONSDEN, GORDON et MARTIN inventent la chromatographie de partage sur papier (le papier servant de support de la phase stationnaire) . Le principe  consiste à plonger l'extrémité d'une bande de papier filtre dans un solvant organique saturé d'eau. On dépose à cette extrémité une goutte de la solution à analyser : par capillarité, la phase mobile avance sur le papier. Au fur et à mesure que le solvant progresse, les constituants du soluté se répartissent suivant leur coefficient de partage entre le solvant et l'eau retenue par la cellulose du papier.


1948 Archer John Porter Martin avec la collaboration du Dr A. T. James met au point la chromatographie en phase gazeuse pour séparer des mélanges d'acides et d'amines.


Principe:

 

La chromatographie est une technique analytique qui permet la séparation des constituants d'un mélange en phase homogène liquide ou gazeuse.
Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire (emprisonnée dans la colonne) et la phase mobile (l'éluant) qui se déplace.
La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants présents dans la colonne.
Ces derniers la parcourent avec des temps proportionnels à leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, ...). A leur arrivée en bout de colonne, le détecteur mesure en continu la quantité de chacun des constituants du mélange.


Le type de support utilisé pour la séparation des constituants d'un échantillon permet de distinguer plusieurs types de chromatographie:

La chromatographie d'absorption (interraction chimique)
La chromatographie de partage (solubilité dans l'une des 2 phases)
La chromatographie d'affinité (reconnaissance par forme)
La chromatographie d'échange ionique (force ionique)
La chromatographie de filtration (exclusion par taille)

La chromatographie d'adsorption:


On la définie également comme une chromatographie solide-liquide car elle est basée sur une séparation des solutés au moyen de 2 forces opposées:

La rétention par adsorption sur la phase stationnaire.

L'entrainement par le courant de l'éluant sur la phase mobile.

L'adsorption est un phénomène de surface lié à la polarité des molécules.
Lors du passage du soluté, des interractions polaires s'effectuent entre celui-ci et la silice  tandis que l'éther de pétrole (apolaire) passe sans éluer la molécule du soluté.


Exemple d'application:


La technologie CCM ou chromatographie sur couche mince.

     

       Avantage:


Simple et rapide à mettre en oeuvre

Coût faible

Analyse qualitative uniquement

     

       Principe:


On utilise pour la phase mobile un solvant ou un mélange de solvants et pour la phase stationnaire un adsorbant (comme une couche d'environ 0,25mm de géle de silice, l'alumine, le kieselguhr ou la cellulose) avec un liant (comme le sulfate de calcium hydraté, l'amidon ou un polymère organique) permettant ainsi la fixation de celui-ci sur une plaque de verre, d'aluminium ou de plastique. L'échantillon (environ un microlitre de solution diluée (2 à 5%) du mélange à analyser) est déposé ponctuellement sur la plaque. Les constituants de l'échantillon sont élués par la phase mobile qui grimpe par capillarité vers le haut de la plaque. Ils peuvent être identifiés par comparaison avec l'élution simultanée de témoins.


       Protocole expérimental:


La préparation de l'échantillon se fait par l'intermédiaire de solvants volatils qui peut être différent de l'éluant. Les solvants les plus utilisés sont le chloroforme, la propanone et le dichlorométhane.


Le dépot de l'échantillon se fait en un point de la plaque situé à environ 1cm de la partie inférieure à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en appuyant légèrement et briévement l'extrémité de la pipette sur la couche adsorbant. Le dépot ne doit pas dépasser 3mm de diamétre.


Préparation de la cuve et mise en place de la plaque dans le cas de la chromatographie ascendante:

on verse l'éluant  à environ 0,5 cm du fond de la cuve.  la plaque est  ensuite placée en position verticale dans la  cuve et l'éluant qui en recouvre le fond monte par capillarité. on place un papier absorbant et on ferme la cuve de manière à former un environnement saturant de vapeur  afin d'éviter l'évaporation de l'éluant lors de son ascension le long de la plaque.


La migration: pendant  la migration, la cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée. Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1cm de l'extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée à l'air libre ou à l'aide d'un séchoir.


NB: Attention dans le choix de l'éluant:


Un éluant trop polaire entraine tous les constituants de l'échantillon. Aucune séparation n'est effectuée.

Un éluant trop apolaire n'entraine pas assez les constituants de l'échantillon. les spots obtenus risquent d'être un mélange de constituants de l'échantillon.


La révélation:

Si les composants de l'échantillon sont colorés, il facile de les repèrer sur la plaque.

Si les composants de l'échantillon sont invisibles, on les rend visibles par des méthodes usuelles de révélation comme la radiation UV, la fluorescence, l'iode ou l'atomisation.


La méthode par la radiation  UV est une méthode de révélation non destructive. Les composants de l'échantillon apparaissent sous forme de taches brillantes. On peut également incorporer un indicateur fluorescent à l'adsorbant. Lors de la révélation au radiation UV,  la plaque entière devient fluorescente tandis que les composants de l'échantillon apparaissent sous forme de taches sombre.


La méthode par exposition de la plaque aux vapeurs d'iode est une méthode non destructive. La plaque est placée dans un atmosphère saturé en vapeur d'Iode. Les composants apparaissent sous forme de taches brunes par fixation réversible de l'Iode. La coloration est labile et disparaît après élimination des vapeurs d'Iode.

 




Chromatographie sur couche mince
envoyé par soschimie
La chromatographie de partage:

On la définie également comme une chromatographie liquide-liquide  ou liquide gazeux.
Cette chromatographie est fondée sur la répartition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase mobile. On joue sur la notion se solubilité.

C'est une technique qualitative.

Principe de partage:

Lorsque l'on ajoute un composé dans un milieu comprenant deux phase liquides non miscibles en contact, celui-ci va se répartir dans ces deux phases dans des proportions bien définies dépendantes de son coefficient de partage K entre ces deux phases. Ce coefficient est une constante thermodynamique d’équilibre définie à une température T et à un pH donné, relative à l'équilibre suivant :








on a alors :

K=K°(T)= [concentration dans la phase 2] / [ concentration dans la phase 1]

La chromatographie de partage peut se réaliser selon 2 types de polarité de phase:

La polarité de phase normale
La polarité de phase inverse

Dans le cas de la polarité de phase normale, la phase stationnaire  est hydrophile et la phase mobile (l'éluant) est hydrophobe.
Dans le cas de la polarité de phase inverse, la phase stationnaire est hydrophobe et la phase mobile (l'éluant) est hydrophyle.

NB:
La phase stationnaire peut être constituée par un film liquide imprégné sur un support rigide ou fixé (gel de silice) par liaison covalente (phases greffées).  Le greffage est réalisé par silanisation créant ainsi des ponts siloxane (Si-O-Si) .

Exemple d'application:

La chromatographie sur papier unidimensionnelle en polarité de phase normale

Principe:

La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau .La phase stationnaire est constituée par l'eau elle même, absorbée par la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en chromatographie sur couche mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant qui se déplace par capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.
 

utilisation:
La chromatographie sur papier est employée principalement pour l'analyse de composés très polaires, tels que les acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels.

 Inconvénients:
Ses plus grands inconvénients par rapport à la chromatographie sur couche mince sont :

               - une durée de développement beaucoup plus longue

               - une séparation généralement moins bonne.


Ps: l'utilisation de papiers spécifiques est fortement recommandé car ceux-ci possédent un faible taux d'impuretés et  des caractéristiques physiques unifor
mes.
exemples : papier Whatman;Schleider; Shüll; Durieux; Arches.


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L'électrophorèse

2 Juillet 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

Histoire:

L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892.  Ils se sont inspirés des études de  Hermann Von Helmholtz menées sur l'électro-osmose. Celui-ci constate qu'il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe  opposé à leur charge.

En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'électrophorèse libre. Cette technique
lui a permis de séparer les protéines du serum sanguin en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée afin de réaliser des mesures optiques au travers du tube.
Il a pu ainsi obtenir sur le pôle + des protéines de charge très négative comme l'abumine et sur le pôle - des protéines de charge plus positive comme les globulines.
Cette technique ne permet  toutefois pas de séparer totalement les protéines. Il est néanmoins possible de mettre en évidence les frontières formées par des méthodes optiques comme la fluorescence, l'absorption des UV ou l'indice de réfraction.

En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant la technique d'électrophorèse sur papier.

En 1952,
Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode connue sous le nom d'analyse immuno-électrophorétique, qui permet d'analyser de manière précise des mélanges très complexes d'antigènes. Dès la première application de cette méthode à l'analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30 constituants indépendants, alors que l'électrophorèse en veine liquide ou sur papier ne permettait d'isoler que 5 ou 6 groupes de protéines. La méthode est rapidement utilisée dans de nombreux laboratoires médicaux pour des besoins de diagnostiques.

En 1955,  O. Smithies met au point la technique d'électrophorèse en gel d'amidon.

En 1957, Joachim Kohn sépare les différents phénotypes de l'hémoglobines en élaborant la technique d'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose.

En 1969, Beber et Osborn
introduisent l'agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les différentes sous-unités protéiques.

Principe:

L'électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique)  sous l'effet d'un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode respective: les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (potentiel positif)  et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (potentiel négatif). En ce qui concerne les molécules non chargées,  il n'existe pas de migration. Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l'électrophorèse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la matrice par ces ions différent. Cela permet ainsi de les séparer.

Avantages:

L'électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps.
La séparation est fine.

On peut déterminer 2 types d'électrophorèses:

L'électrophorèse dite "libre" en veine liquide (mise au point par Tisélius en 1937).
L'électrophorèse de zone sur support.

L'électrophorèse en veine liquide.

La migration dans ce type d'électrophorèse s'effectue au sein d'un liquide de composition déterminée soumis à un champ électrique de courant continu (cf. Histoire).

Avantage:

Permet une bonne détermination des mobilités électrophorétiques.

Inconvénients:

Appareillage couteux
.
La mise en oeuvre et longue et délicate.

Les particules ne se séparent pas complètement mais il se forme des frontières mise en évidence par des méthodes optiques telles que l'absoption ultra-violette pour les protéines.

L'électrophorèse de zone.

Ce type d'électrophorèse utilise un support poreux pour stabiliser la phase liquide.  Le support doit être homogène, poreux et inerte. Différents types de support peuvent être utilisés:
Support en papier ou acétate (la migration des mélanges s'effectue à la surface de celui-ci).
Support en polyacrylamide ou agarose (la migration des mélanges s'effectue à l'intérieur même du support).

Avantages:

 
Les fractions séparées migrent comme des "zones" individuelles.

La taille des mailles ("pores")  pour les supports en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentir le déplacement des grosses molécules)
.

2 types de montage peuvent être mis en place:

Montage horizontal:

Utilisé pour les supports en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme de longue et
étroite bande.
Les extrémités du support plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa surface.

Montage vertical:

Utilisé pour les supports en gel polyacrylamide ou, plus rarement d'agarose . Le gel est souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Durant la gélification on aura pris soin de faire des puits où on déposera les échantillons. Chaque extrémité du gel est mis en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui permettra la propagation d'un courant dans le gel.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):

Cette technique est très utilisée en immunologie et dans l'étude des protéines car elle permet, après la séparation des différentes protéines, leur transfert sur une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène afin d'être identifier par le biais d'anticorps spécifiques.

Cette technique est également utilisée pour le séquençage de l'ADN (les méthodes traditionnelles de Maxam et Gilbert ou de Sanger permettent de séquencer  à la  paire de bases près).

La matrice de cette électrophorèse:
Le gel  de polyacrylamide est constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant. En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient différents maillages et donc différentes densités de gel.
La polymérisation est réalisée grace à l'ajout de 2 réactifs: le TEMED (N,N,N',N' tetra-méthyl-èthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent des anions hyperactifs en présence de lumière.

La densité typique d'un gel de séparation peut être à 6%; 8%; 10%; 12% ou 15%.
Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des protéines.
Des niveaux de densité plus faibles du gel permettent de séparer des protéines de poids moléculaires proches.

La densité d'un gel de concentration  (stacking gel) est à 5%. Ce gel est coulé en haut du gel de séparation. Il permet à l'échantillon une entrée homogène dans le gel de séparation. On utilise un "peigne" afin de créer des "puits" individuels pouvant accueillir chaque échantillon.

Le SDS-PAGE:
Une variante de cette technique consiste à utiliser du SDS (Sodium Dodécylsulfate) qui est un détergent anionique fort.  Il a la propriété de défaire la structure spatiale en se fixant sur les protéines et de les charger de la même façon permettant ainsi de les séparer uniquement en fonction de leur masse moléculaire.
Les protéines sont dites dénaturées: elles ont perdu leur structure tridimentionnelle native.

 Avant de procéder à la dénaturation des protéines avec du SDS, on utilise un agent réducteur, le b mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des proteines  les rendant ainsi sous forme monomérique.
****
Protocole expérimental:

préparation des échantillons:

Les échantillons vont être traités dans
du tampon de dénaturation . Celui-ci sera préparé au dernier moment.

tampon de dénaturation se compose:
de tampon Tris Hcl 0,125 mL pH 6,8
d'eau distillée;
de SDS à 4%
de b mercaptoéthanol à 10%;
de bleu de bromophénol à 0,2%
de glycérol pur

50 microlitres d'échantillons sont mélangés avec 50 microlitres de tampon dénaturant.
L'ensemble est ensuite chauffé pendant 4 minutes afin de favoriser la dénaturation des protéines.

Le matériel d'électrophorèse se compose:
des plaques
des pinces
le joint d'étanchéité
Le peigne
les espaceurs

On nettoie les plaques avant utilisation à l'aide d'eau (éventuellement savonneuse) puis avec de l'alcool à 70%. On essuie les plaques avec un papier, sans laisser les fibres sur les faces où sera coulé le gel.
On pose le joint d'étanchéité sur la plaque à bords rond.
Puis, mise en place des espaceurs et de la deuxième plaque en verre. L'ensemble est ensuite consolidé à l'aide des pinces.

Préparation de 30 ml de gel de séparation:
7,50 mL d'acrylamide bis acrylamide
11,25 mL de tampon Tris/Hcl  pH8,8
0,30 mL de SDS à 10%
10,95 mL
d'eau

pour la polymérisation on ajoute
30 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
300 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%

La préparation est aussitôt coulée entre les 2 plaques à l'aide d'une pipette. Afin d'éviter la présence de bulle dans le gel, on incline le montage lors du remplissage. Le gel est ensuite recouvert d'eau distillée afin d'obtenir une surface parfaitement horizontale.

Préparation de 10 ml de gel de concentration:

1,25 mL d'acrylamide bis acrylamide
1,25 mL
de tampon Tris/Hcl  pH6,8
0,10 mL
de SDS à 10%
7,4 mL
d'eau

pour la polymérisation on ajoute
 40 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
 100 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%

Retirer l'eau distillée au dessus du gel de séparation puis remplir le montage comme précèdemment jusqu'au niveau supérieur des plaques de verre.  Le peigne est alors mis en place pour former des puits dans le gel de concentration.

Préparation d'un litre de tampon de migration:

12,5 mL de Tris 25mM
14,4 g de glycine
977,5 mL d'eau distillée
10 mL SDS 10%

Le peigne est retiré puis les plaques et les cuves de migration sont placées sur le support . Les cuves sont remplies avec le tampon de migration en commençant par la partie supérieure puis inférieure.  Dépot de 50 microlitres d'échantillon protéique dénaturé dans chaque puit à l'aide d'une seringue et selon la technique sous-marine.
Les électrodes de la cuve sont reliées au générateur. La migration se fait à 30 mA jusqu'à ce que le bleu de bromophénol atteigne le bord inférieur des plaques.

Révélation:
Le gel est retiré des plaques puis placé sur un agitateur et coloré pendant 30 minutes dans une solution de coloration composée de bleu de coomassie à 2,5%,d'isopropanol à 20%, d'acide acétique à 20% et d'eau à 57,5% puis décoloré pendant 3 fois 30 minutes avec une solution décolorante composée de 45% d'isopropanol, de 10% d'acide acétique et de 45% d'eau.



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La technique ELISA

8 Avril 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

Histoire:

La technique d'ELISA a été conceptualisée et développée par 2 scientifiques suédois, Peter Perlmann (investigateur principal) et Eva Engvall à l'Université de Stockholm en 1971.

A la fin des années 60, Stratis Avrameas et GB Pierce mettent au point la technique d'immunoenzymologie, technique d'analyse par réaction entre antigènes et anticorps et utilisant comme marqueur des enzymes.

Principe:

La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet  de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.

Avantages de la technique:

  • L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.
  • Possibilité de quantifier grâce à la réalisation d'une gamme en parallèle.
  • L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible.
  • technique accessible à tous les biologistes.
  • La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage spécialisé.
  • La validité des trousses est d'environ 1 an.
Inconvénients de la technique:
  • La limite de détection est moins bonne que la technique RIA.
  • La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température, du pH et de l'éclairement.
Le test ELISA indirect:

Ce test permet de détecter ou doser des anticorps.
il se réalise en 4 étapes:

La première étape appelée "coating" de l'antigène:
Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les plaques sont incubées à 4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage.

La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de lavage.


La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de détection:
On incube à 37°C dans  les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent  spécifiquement sur les anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grace à l'apparition d'une coloration.

La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:
On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la présence de l'anticorps à doser. L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps recherché.

Exemple d'application:

Identification dans le sérum du patient, les anticorps anti-protéines de l'enveloppe et du corps du virus de l'immunodéficience humaine.
 


Le DAS ELISA direct ou Double Antibody Sandwich ELISA direct:
Dans ce cas de figure, l'antigène se trouve entre 2 anticorps spécifiques. L'utilisation de la DAS ELISA nécessite de posséder 2 anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents sur l'antigène.

La première étape consiste à fixer sur le support, l'anticorps de capture. On incube la solution à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.

Lors de la deuxième étape, on dépose l'échantillon possédant l'antigène à identifier qu'on laisse incuber à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.

Dans une troisième étape, on fixe l'anticorps de détection marqué avec une enzyme sur l'antigène recherché. Pour cela, on dépose la solution d'anticorps dans les puits puis on incube l'ensemble à 37°C pendant 2 heures.

La dernière étape, on  dépose
une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme et on laisse incuber pendant 30 à 120 minutes. Le produit de réaction obtenu est soluble et coloré. L'intensité de cette coloration peut être mesurée à l'aide d'un photomètre.
NB: la différence entre le DAS ELISA direct et le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine réside au niveau de l'anticorps de détection. Pour le DAS ELISA indirect
par le système biotine-streptavidine
, l'anticorps de détection porte une molécule de biotine qui interragie avec la streptavidine couplé à une enzyme.


La sensibilité du test DAS-ELISA direct se situe entre 1 et 10 ng/ml. Cette sensibilité peut être augmentée par l'utilisation du système indirect du fait de la forte affinité entre la streptavidine et la biotine.
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Les anticorps monoclonaux

11 Mars 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

Définition:

Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont  identiques car produits par un clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes). Les anticorps monoclonaux sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic et dans des buts thérapeutiques.

La production de ces anticorps  in-vitro est très difficile à cause de la faible durée de vie des plasmocytes.

In-vivo, la production de ces anticorps peut être obtenue en injectant chez l'animal un antigène donné puis extraction de ceux-ci dans le sang. Cette méthode est très couteuse et très peu d'anticorps sont obtenus.

L'élaboration de la technique des hybridomes par César Milstein et Georges köhler en 1975 a permis d'obtenir une grande quantité d'anticorps à faible coût et ainsi permettre de les utiliser  dans de nombreuses applications.
Cette technique consiste à injecter l'antigène d'intérêt chez une souris puis de prélèver, au bout de quelques semaines, les cellules de la rate. Parmis ces cellules se trouvent des plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi. On fusionne ces plasmocytes avec des cellules de tumeur appelées cellules myélomateuses (cellules immortelles) grâce à l'addition de polyéthylène glycol (PEG) qui induit la fusion membranaire et permet ainsi d'obtenir des hybridomes qui ont la capacité de se multiplier plus rapidement que les cellules normales du corps productrices d'anticorps et de développer indéfiniment des anticorps spécifiques. Les cellules sont ensuite réparties dans des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits. Afin d'éliminer les plasmocytes et les cellules myélomateuses non fusionnées, on utilisera un milieu de culture sélectif (milieu de culture HAT). Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et les cellules myélomateuses utilisées ayant un gène non fonctionnel pour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides-hypoxanthine - guanine - phosphoribosyl - transférase (HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT (hypoxanthine aminoptérine thymidine).
Seules les cellules hybrides se multiplient. Au bout d'une dizaine de jours, on recherche dans chaque puits la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène utilisé pour immuniser la souris. On repique les cellules productrices. On isole ainsi quelques clones cellulaires producteurs qui pourront être conservées dans l'azote liquide.
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Exemples d'application:


  • Test d'ovulation: les anticorps monoclonaux anti-hormone lutéinisante qui révèlent l'augmentation du taux d'hormone LH (signe précurseur de l'ovulation).

  • Test de grossesse: le principe repose sur la détection de l'hormone hGC (human Chorionic Gonadotropin) dans les urines par le biais d'une réaction colorée spécifique grâce à l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-hGC.

  • Fabrication des anticorps monoclonaux contre des antigènes portés par des cellules tumorales afin de les détruire. L'intérêt de l'utilisation des anticorps monoclonaux pour un traitement anti-cancereux réside dans la spécificité de ceux-ci à détruire des cellules cibles. On peut soit utiliser des anticorps seuls (anticorps nus) qui en s'attachant à la cellule entraînent sa mort ou associés à une autre molécule comme une toxine ou un produit radioactif. L'anticorps sert dans ce cas là, à amener vers la cellule tumorale l'élèment qui va la détruire.

  • Test ELISA: utilisation des anticorps monoclonaux comme anticorps traceurs dans le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Ce type de test est utilisé notamment dans le dépistage de la séropositivité au virus VIH, c'est à dire pour mettre en évidence la présence d'anticorps anti-VIH dans le sérum.
Inconvénient :
Comme la plupart des anticorps monoclonaux sont produits dans des cellules de rongeurs, on peut observer une réaction immunitaire lors de leur injection chez un patient. Cette imunité inactive progressivement l'action bénéfique de l'anticorps monoclonal. Pour remédier à ce problème, on produit des anticorps "chimériques" ou "humanisés".

Les anticorps "chimériques" sont obtenus par greffage des parties constantes d'immunoglobuline humaine sur les parties variables d'un anticorps de souris.
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les anticorps “humanisés” sont produits par fermentation microbienne ou par des souris transgéniques contenant seulement une partie des gènes humains à l'origine des Anticorps. Ils sont potentiellement mieux tolérés dans l'organisme humain.
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La PCR

25 Février 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

Présentation de la PCR:

cette technique fut imaginée par le scientifique américain Karry Bank Mullis et développée par le Dr H.A. Herlich avec la collaboration de la compagnie Cetus en 1985.

La PCR ou Polymérase Chain Reaction conduit à l'amplification in-vitro de plusieurs millions de fois une séquence spécifique d'acide nucléique qui peut être minoritaire voir très rare (10-2pg). Elle exploite le processus de la réplication et fait appel, pour cela, sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d'un ADN servant de matrice. Pour initier le processus, des amorces (ou primer) s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN polymérase de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de nouveaux ADN doubles brins.

La PCR s'effectue sur 3 étapes:

  • La dénaturation thermique de l'ADN: à 95°C, les liaisons d'hydrogènes sont rompues et les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme simple brin dans le milieu.
  • Hybridation des amorces: le milieu réactionnel contient 2 amorces, chacune complémentaire d'un des 2 brins. La température permettant la fixation des amorces sur les monobrins d'ADN est comprise entre 50°C et 65°C. Les amorces en larges excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires.
  • Extention des amorces: intervention de la taq polymérase (ADN polymérase) qui allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléiques complémentaires de la séquence de la matrice auquel elle est hybridée. Cette étape s'effectue à une température de 72°C.
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  • Au deuxième cycle: la quantité d'ADN continue de doubler et les premiers brins dont la taille est limitée par les 2 amorces font leur apparition.
  • Au troisième cycle: Les premiers amplicons apparaissent (ADN double brins borné par les amorces correspondant au fragment d'ADN recherché).

En théorie, après n cycles, on augmente le nombre d'ADN interressant  de 2n.
En pratique, le nombre de brins est limité à cause de la baisse de certains réactifs, l'augmentation de la viscosité du milieu et la baisse de l'activité de l'ADN polymérase thermostable.
A l'issue de la PCR, on obtient des fragments de même taille correspondant à la distance en base qui sépare les amorces
.

La technique PCR se réalise par le biais d'un appareil programmable appelé un thermocycleur dans lequel sont placés les microtubes contenant le mélange réactionnel. Cet appareil permet d'exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l'expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide, elle ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).

Composition du mélange réactionnel dans les microtubes:

Le mélange s'effectuera toujours sur la glace et les différents élèments qui le compose seront placés dans l'ordre suivant dans les microtubes:
H20, le tampon, MgCl2, les nucléotides, les amorces, l'enzyme ( taq polymérase) et enfin l'ADN à amplifier.
NB: on réalise toujours un témoin dans lequel l'ADN est remplacé par de l'eau (témoin négatif) afin de déceler une éventuelle contamination (
la contamination par de l'ADN précédemment amplifié représente le principal risque). Un témoin positif permettra de valider la bonne conservation des réactifs, de l'enzyme responsable de la polymération et des performances du thermocycleur. un témoin interne présent dans le milieu réactionnel renseignera sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de l'amplification.

Révélation des produits d'amplification:

Lorsque la quantité de produits d'amplification est suffisante, ceux-ci sont soumis à une électrophorèse  en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt (Bromure d'éthydium: produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques faisant apparaitre à la molécule d'ADN une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 30 nm)). La vitesse de migration étant dépendant de la masse de la molécule, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons peuvent être facilement vérifiable sur le gel.

Intérêts de la technique PCR:
  • La PCR peut être un outil très avantageux dans la détection de génes mutés responsables de cancers et de maladies génétiques.
  • Elle peut également être très utile pour le suivi des thérapies anticancéreuses et ainsi permettre au médecin de poursuivre ou pas le traitement.
  • Comme certains cancers  sont induits par translocation chromosomique, la PCR identifie la présence ou pas de réarengements chromosomiques  avec une sensibilité plus importante par rapport à d'autres techniques (elle peut ainsi détecter une cellule cancéreuse pour un million de cellules normales).
  • La PCR peut servir dans la détection d'infection virale ou bactérienne. Elle est utilisée dans l'identification du virus du SIDA.
  • La PCR peut intervenir dans l'étude concernant l'évolution des espèces. La divergence des espèces à partir d'un ancêtre commun est reflétée par le degré de divergence entre les séquences nucléotidiques des génes. La mesure de cette divergence nucléotidique peut être utilisée pour déterminer le lien de parenté entre différentes espèces.
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Identification bactérienne par la coloration de GRAM

18 Février 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mis au point le protocole en 1884.
Les bactéries présentent toutes une paroi constituée d'une substance, la muréine qui est un peptidoglycanne. Celle-ci est recouverte par une membrane externe chez les bactéries Gram-, tandis que les bactéries à Gram+ en sont dépourvues. Cette paroi de part son organisation permet de les classer soit dans les Gram+ ou les Gram-. Cette information est importante car elle est utilisée dans la taxonomie. Elle permet ainsi, avec la reconnaissance de la morphologique et le mode de groupement des bactéries de renseigner sur l'ordre dont fait partie les bactéries étudiées.

Cette coloration de Gram se réalise en 7 étapes
:
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On réalise un frottis sur une lame de microscope à partir d'une suspension bactérienne: on agite la suspension afin de l'homogénéiser et d'éviter d'avoir un culot au fond du tube. Avec l'aide d'une anse que l'on aura préalablement stérilisé (en la passant sous le bec benzène), on prélève un peu de la solution bactérienne en plongeant le fil de platine de la anse dans le tube à essai. 

2 On
dépose ensuite ce prélèvement au milieu de la lame en faisant des rotations jusqu'à séchage.

3 On procède à la fixation du frottis soit avec de l'éthanol à 90° (5 minutes) puis on enflamme la lame ou on passe directement 3 fois la lame dans la flamme du bec Bunsen.

4 La coloration au violet de Gentiane (colorant basique): la lame est plongée pendant 2 à 3 minutes (en fonction de la concentration) dans la coloration au violet de gentiane. Toutes les bactéries sont colorées en violet puis rincer à l'eau déminéralisée.

5 Mordançage au lugol (solution iodo-iodurée) : étaler le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. Cette étape permet de stabiliser la coloration violette.

 

6 Décoloration à l'alcool: verser goutte à goutte l'alcool sur la lame inclinée obliquement. Surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée. L'alcool pénettre dans la bactérie. La coloration au violet de Gentiane disparait. Les bactéries décolorées sont des bactéries Gram-. Si l'alcool ne traverse pas la paroi, on est en présence de bactéries Gram+.

 

7 Contre coloration avec de la Fuchsine ou de la Safranine: laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.  Les bactéries Gram- sont colorées en rose.


Exemples:

Les bactéries à Gram+:
Les Staphylocoques apparaissent en "grappe de raisin" violette.
les Streptocoques sous la forme d'une chainette violette.

Les bactéries à Gram-:
Echérichia coli (enterobactérie) apparait sous la forme de bacille rose.


Pourquoi les bactéries à Gram- ne restent-elles pas colorées en violet après la décoloration à l'alcool comme les bactéries à gram+?

La paroi des bactéries Gram+ est composée d'une 40ène de couche de peptidoglycanne ne permettant pas à l'alcool de traverser cette paroi épaisse tandis que la paroi des bactéries à Gram- n'est formée que d'une seule couche de peptidoglycanne.
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La culture cellulaire

6 Février 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

Définitions:


On appelle culture d'organe, le maintien en dehors de l'organisme, d'organes ayant conservé leur structure et leur fonction (coeur perfusé).

On appelle culture de tissu, le maintien en dehors de l'organisme, des tissus de manière à conserver les fonctions spécifiques de chaque tissu.

On  appelle culture cellulaire, le maintien en dehors de l'organisme, des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro et d'exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques.

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cellule humaine en mitose

Histoire:


3 périodes vont marquer le développement de la culture cellulaire.


La période des précurseurs (1885, 1900). Cette période annonce la première méthode de culture de tissu en dehors du corps, grace au Professeur Ross Harrison  qui a pu cultiver des neuroblastes de grenouille dans un milieu de lymphe et ainsi franchit un premier pas vers la recherche actuelle sur les cellules souches et dérivées.

La période de la culture de tissus (à partir de 1902). Cette période est dominée par Alexis Carrel qui oriente le développement de la culture de tissus suivant 3 voies principales:
  • L'amélioration des techniques d'obtention des tissus.
  • L'élaboration des règles d'aseptie.
  • L'étude des besoins nutritionnels.

La culture cellulaire n'apparait proprement dit qu'à partir de 1952 lors de l'introduction de la trypsinisation des tissus par Moscona en 1952. Il procéde à la digestion de tissu d'oeuf de poulet avec de la trypsine afin d'obtenir des cellules isolées  ou des amas de cellules capables de se diviser in-vitro.

Les techniques d'obtention des cellules:

On distingue 2 types de cellules:
  • Les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang
  • Les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu.
Les techniques d'obtention de ces 2 classes de cellules sont différentes.
  • Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et centrifugation.
  • Les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en oeuvre de techniques plus originales qui peuvent être divisées en 2 groupes: la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique.
La méthode par dissection:

Cette méthode est la plus ancienne. Elle a permis aux précurseurs de la culture de tissu d'obtenir les premières cellules in-vitro.

La méthode de Carrel consiste à prélever un morceau de tissu qui est réduit en un très petit rectangle et déposé à la surface d'un mélange de 2 gouttes de plasma de coq et de 2 gouttes d'extrait embryonnaire à 50%. Après un séjour de 24H à l'étuve, on voit migrer les premières cellules à partir de l'explant.

La méthode de dissection consiste à couper en fragment d'environ 1 à 4 mm3  le tissu que l'on réduit encore à l'aide de pince. Ces fragments sont ensuite placés dans un flacon de culture contenant un milieu nutritif.  Les cellules vont migrer à partir des différents fragments puis se multiplier. Cette méthode s'appelle également la méthode des explants.

La méthode Jensen:

Cette technique est plus rarement utilisée.
Les fragments de tissus de 1 mm3 sont placés sur un disque de papier filtre qui repose sur un support métallique dans une boite de pétri . Les cellules qui prolifèrent à partir du fragment du tissu traversent les pores du papier et se fixent au fond de la boite. Cette technique donne l'avantage d'une séparation constante entre l'explant et les cellules migrantes évitant l'étape délicate de l'élimination de l'explant lorsque une couche subconfluente est obtenue.

La méthode mécanique:
Cette technique s'applique pour des tissus mous comme le thymus, la rate. Elle consiste à frotter le tissu sur une grille puis de filtrer et centrifuger. On peut également dilacérer les tissus à l'aide d'une pipette en verre en pipetant et refoulant les tissus.


La méthode par digestion enzymatique:

Les enzymes utilisées sont des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame protéique qui entoure les cellules. on utilise souvent la trypsine à une concentration de 0,5 à 2,5 g/l dans une solution saline.

Les avantages et les inconvénients de ces méthodes.
  • La méthode par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très petit. L'obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement long (environ 30 jours).
  • La méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode.
Les méthodes de culture:

La culture stationnaire ou monocouche:

Le principe général de cette méthode est lié à l'affinité des cellules au support car la plupart appartient à des tissus solides organisés.
Le support peut être du verre ou du plastique traité pour la culture. Le plastique peut être recouvert de support physiologique: collagène, fibronectine ou d'une membrane basale reconstituée ou encore l'utilisation de gèle d'agarose, de géle de collagène pour une orientation vers la culture 3D.undefined

Les cellules sont placées dans des boites micropuits de diamétres différents ou sur des microporteurs (microbilles en plastique) recouverts ou non de support physiologique. Les microporteurs sont ensuite placés dans des récipients puis soumis à une agitation modérée et continue permettant aux cellules de demeurer dans le milieu de culture. Le rendement de cette technique est importante. Cela étant dû à une surface d'adhérence plus grande.

La culture en suspension:

Comme la plupart des cellules ont besoin d'un support pour croître, il faut donc trouver un artifice pour maintenir la plupart de celles-ci en suspension.
En 1933, Monsieur Gey arrive à faire croître dans des tubes en verres, des cellules en suspension tournant à grande vitesse.

L'agitation peut être réalisée par différents moyens:
  • Elle peut être entretenue par des barreaux magnétiques siliconés appelés "SPINNER"
  • Il existe également des appareils d'agitation perfectionnés appelés des cytoculteurs qui permettent de maintenir une densité cellulaire,un environnement gazeux constant ainsi qu'un apport continu de milieux  frais et la récupération de milieux usés.
Contrôles fonctionnels des cellules en culture:
Deux caractéristiques sont à considérer:
  • La prolifération des cellules.
  • La préservation des fonctions spécialisées.
Selon que l'on débute une culture ou qu'on est en culture de routine, les paramétres de contrôle différent.

Les contrôles réalisés lors de la mise en route d'une culture:

On vérifie les conditions s'aseptie lors de la dissection et augmente la dose d'antibiotique et fongique si nécessaire.
On vérifie l'état des cellules recueillies par le bleu de trypan.


Le bleu de  trypan est un colorant qui a tendance à entrer dans les cellules qu'il rencontre. Une fois dans la cellule, la molécule en question entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et restera bleue. Cependant, cette molécule étant toxique, elle finit par tuer les cellules qui deviennent alors toutes bleues.

On vérifie la morphologie des cellules au microscope et la présence d'un marqueur biochimique spécifique du type cellulaire.

Les contrôles de routine:


Vérifier la morphologie des cellules au microscope ainsi que l'adhérence de celles-ci. Le manque d'adhérence peut dévoiler l'absence de place pour la croissance des cellules, l'inadéquation du support, un milieu "usé".  Le remplacement du milieu s'effectue tous les 2 à 3 jours. Le milieu doit être neutre ( pH 7,2 à 7,4). Inférieur à 6,5 la viabilité des cellules est menacée. Il est donc important d'utiliser un indicateur pour vérifier l'acidité du milieu comme le rouge de phénol dont le pH à l'équivalence se situe dans sa zone de virage (entre 6,6 et 8,4). En dessous de 6,6 le rouge de phénol vire au jaune.

Les techniques d'entretien:

En ce qui concerne les cellules adhérentes, le changement du milieu usé s'effectue par aspiration.
Les cellules en suspension sont tant qu'à eux, soumis à une centrifugation à 800 jets.
Lorsque la population cellulaire est confluente, on rince le milieu avec une solution EBSS (solutions salines équilibrées de earle) et on utilise de la trypsine afin de détacher les cellules cultivées sur boîte de Pétri pour ensuite les repartir sur d'autre flacon.


La conservation des cellules est indispensable pour les cellules à durée de vie limitée et pour les cellules difficiles à entretenir. Elle se fait par cryoconservation.
La conservation de longue durée se réalise dans de l'azote liquide à -180°C. Les cellules sont placées en présence de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), de FCS à 10% et de DMSO (diméthyle sulfoxide)à 10% ou de glycérol (Le DMSO et le glycérol sont des agents cryoprotecteurs) dans des tubes de congélation de 1ml. La concentration des cellules doit être de 10 milliards de cellules par ml.
La conservation de court durée se réalise à -20°C.
La décongélation des cellules se fait de manière rapide, en plaçant celles-ci sous une ampoule dégageant une température de 37°C.


L'évolution des cellules en culture:

Les cellules in-vitro présentent 2 propriétés fondamentales qui sont: la capacité proliférative et leur fonction différentiée.
Ces propriétés ont tendance à évoluer de manière très différentes quelle que soit la méthode de culture employée. Les cellules conservent la plupart du temps leur potentiel de division, pouvant être stimulé au début de la culture par des facteurs de croissances. Même si au cours du temps, on peut noter un ralentissement de celui-ci. A l'inverse, les cellules en culture voient souvent leur fonction différentiée se modifier et même disparaître. Ce phénomène de dédifférentiation peut être visible morphologiquement.
Notons que certains types cellulaires révèlent leur fonction spécifique que lorsqu'ils sont cultivés en vie ralentie. Pour cela, on procéde à un appauvrissement progressif du milieu ou on utilise une substance inhibitrice de la division cellulaire.

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la microbiologie en agro-alimentaire

12 Septembre 2007 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

La microbiologie et ces applications dans les industries agroalimentaires.

Les techniques de culture:

L'intérêt des biotechnologies dans les industries agro-alimentaires est d'obtenir des métabolites utiles, des molécules qui ont un intérêt industriel à partir de matériel biologique. l'obtention de ces molécules se réalisent en 2 étapes:

La production du produit interessant appelé fermenteur:

La production se fait à partir de procédés de fermentation. ils sont constamment développés afin de cultiver les micro organismes dans les conditions optimales pour qu'ils puissent produire les produits désirés.

La récupération du produit formé:

L'extraction et la purification du produit doivent être réalisées par des techniques douces comme l'electrophorèse, la distillation ou la chromatographie.

Les différents systèmes de fermentation:

Il existe 3 grands systèmes de fermentation.

  • Le premier système de fermentation appelé fermentation batch ou discontinue:

le fermenteur est un système clos, fermé. Au temps zéro de la fermentation, la solution de nutriment stérile est inoculée avec des micro organismes (bactéries, levures). l'incubation se réalise dans des conditions d'agitation, de température, de pression partiel en oxygène et de régulation de PH. Au cours de l'incubation, la quantité de micro organismes dans le fermenteur, la concentration en biomasse, en substrat et en produit varie constamment, conséquence du métabolisme microbien.
On peut observer 4 phases de croissances:
une phase de latence
une phase exponentielle de croissance
une phase stationnaire
une phase de mortalitée

  • Le deuxième système de fermentation appelé fermentation fed bath ou bath alimenté:

le substrat est apporté au fur et à mesure de sa consommation par les microorganismes. Ce système est employé dans la production de la penicilline. En effet,celle-ci est soumise à une répression catabolique lors de la présence d'une forte concentration de substrat carboné (le glucose). On procéde à l'ajout du substrat au fur et à mesure de sa consommation afin d'éviter l'accumulation de substrat dans la réaction.

  • Le troisième système de fermentation appelé fermentation continue ou sytème ouvert:

La solution de nutriment est apportée en continue au réacteur mais une quantité équivalente de solution fermentée est prélevée. Le volume est donc constant.

On distingue 2 grands types de fermenteurs continus:
Le réacteur à écoulement piston
Le réacteur infinment mélangé


ces 2 types de fermenteurs différent par le mode découlement de la solution de nutriment.

  • Le réacteur à écoulement piston:
    il est caractérisé par un rapport longueur /largeur très élevé. Le réacteur est cylindrique (10 à 15 mètres de long). La solution de nutriment pénettre à une extrémité du réacteur et la biomasse cellulaire ainsi que la production du produit collecté à l'autre extrémité du réacteur. Dans ce type de réacteur la turbulence est nulle.  Il n'y a aucun mélange, pas d'agitation, pas d'homogénéité. un élèment qui entre dans le réacteur progresse sans mélange avec la molécule qui la précède ou qui la suit. Ceci génère des gradients de concentration à l'intérieur du réacteur. Plus on se situe loin par rapport à l'entré du réacteur, plus la concentration de substrat est faible et plus la concentration du  procuit est élevée. L'inconvénient dun tel type de réacteur est la difficulté de réguler un PH. Celui-ci étant différent en tout point du réacteur.
  • Le réacteur infiniment mélangé:
    l'homogénéité du continu du réacteur est parfaite.
    Tout élèment qui pénettre dans le réacteur est homogénéisé au contenu du réacteur.
    La concentration d'un composé donné dans le réacteur est le même en tout point du réacteur.
    La concentration d'un composé donné dans l'éffluent du réacteur est la même qu'à la concentration de ce composé à l'intérieur du réacteur.
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