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biotechnologie

Articles récents

le test des comètes

22 Février 2010 , Rédigé par par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

histoire:

Cette technique fut mise au point en 1984 par Osting O et Johanson K dans le but de détecter les cassures doubles brins de l'ADN. La lyse et l'électrophorèse fut effectuées dans des conditions neutres et la coloration avec de l'acridine orange (l'acridine se lie à l'ADN et à l'ARN grâce à ses propriétés d'intercalation).
Elle fut ensuite optimisée par Singh et all en 1988 afin de détecter les cassures simples brins et les sites alcali-labiles. L'électrophorèse, dans ce cas présent, se réalise dans des conditions fortement alcalines afin de relaxer et de détendre l'ADN superenroulé.


Principe:

Le test des comètes ou Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) est une technique d'électrophorèse sur microgel d'agarose. Il permet de mesurer les cassures induites directement par un agent génotoxique et indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de fragmentation de l'ADN tel que l'apoptose.

Mode opératoire:

Les cellules après un contact avec un agent altérant la structure de l'ADN (isotopes, agents oxydants ou autres molécules toxiques) pendant un temps donné sont décollées de leur boite de pétri pour y être englobées dans un gel d'agarose et déposées sur une lame de microscope. Elles sont ensuites soumises à l'action d'un agent alcalin (pH 10)  qui a pour effet de lyser les cellules (destruction  des membranes, des protéines et des ARNs) et de libérer les noyaux. Ces derniers sont ensuite incubés dans un tampon d'électrophorèse  basique (pH 13) pour faciliter la dénaturation, la détorsion de l'hélice et l'exposition des sites sensibles aux agents alcalins. L'ADN ainsi relaché,  est soumis à une électrophorèse (de faible voltage et ampérage) puis révélé par addition d'un intercalant fluorescent (le Bromure d'éthydium).
Si l'ADN n'a pas été  endommagé (reste sous forme super enroulé) sera révélé sous forme d'une sphère compacte.
Si l'ADN a été endommagé, celui-ci présentera en plus des fragments simples et doubles brins (plus légers) qui migreront en dehors de cette sphère formant un "halo" d'ADN qui s'étirent en direction de l'anode et décrivent la queue de la comète.
test des comètes
avantages:

  • Cette technique permet de quantifier d'une part les dommages causés à l'ADN par divers agents toxiques et d'autre part la réparation des dommages dans les cellules eucaryotes ainsi  que dans quelques cellules procaryotes in vivo et in vitro.
  • Technique non invasive.
  • Technique sensible (détection d'environ  0,2 à 2 coupures par 109 daltons).
  • Les résultats sont obtenus en quelques heures  par rapport aux techniques conventionnelles.
  • 50 à 100 cellules sont comptées par échantillon par comptage manuel ou en utilisant un logiciel.

inconvénients:

  • Le débit de cette technique est bas, car une électrophorèse correspond à un type cellulaire / un agent toxique / une concentration.
  • Les résultats ne peuvent être comparés que s'ils proviennent d'électrophorèses réalisées ensembles.
Exemples d'application:

  • Evaluation des produits chimiques génotoxiques in vivo et in vitro.
  • Etude sur la réparation de l'ADN (réparation par excision; Strand Break Repair).
  • Etude sur les dommages causés à l'ADN (cassure simple brin; sites alcali-labile; réticulation de l'ADN).
  • En éco-toxicologie: test utilisé pour surveiller des sols et étudier la toxicologie aquatique.
  • Evaluation des polluants génotoxiques provenant de sites de déchets dangereux.
  • Epidémiologie de l'homme:
    • Banque de sang.
    • Suivi de la radio et chimio-thérapie chez les patients cancéreux.
    • Banque de sperme.
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Le test d'Ames pour évaluer le pouvoir cancérigène d'une substance

26 Janvier 2010 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:


Ce test biologique  fut décrit en 1973 par Bruce Ames.


Intérêt:


L'apparition d'un cancer est souvent lié à des dommages causés dans l'ADN. Ce test permet d'estimer le potentiel cancérigène d'une substance.


Principe:


Le test d'Ames évalue la facilité qu'une substance induise une réversion dans l'expression des gènes pour l'histidine sur des souches bactériennes mutagènes de Salmonella typhimurium. La mutation rend les bactéries auxotrophes, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent se développer que dans un milieu possédant cet acide aminé contrairement aux bactéries sauvages  (prototrophes) qui poussent dans un milieu  qui en est dépourvu. On cherche l'apparition de souches mutantes.

Pour s'assurer que la réplication de l'ADN puisse se faire en présence du mutagène potentiel, les bactéries et la substance analysée sont mélangées dans de l'agar mou auquel on ajoute de faibles quantités d'histidine. Cet agar mou est ensuite étalé à la surface de boîtes d'agar réalisées avec un milieu minimum. Les boîtes sont incubées 2 à 3 jours à 37°C. Les cellules auxotrophes pour l'histidine pousseront quelques heures jusqu'à épuisement de l'histidine du milieu d'agar mou. Seules les révertants, ayant retrouvé la capacité à synthétiser de l'histidine, seront ensuite capables de se développer sur ce milieu minimum. Les colonies sont ensuite dénombrées et la valeur obtenue sera comparée à un témoin afin d'estimer le pouvoir mutagène relatif de la substance vis-à-vis de ces souches auxotrophes pour l'histidine.

test d'ames

Particularité des souches bactériennes:

  • Les bactéries doivent posséder un caractére provoquant la formation de parois dépourvues d'un lipopolysaccharide  rendant les cellules perméables à de nombreuses substances.
  • Les bactéries sont déficientes dans leur système de réparation de l'ADN par excision et possédent des gènes plasmidiques favorisant un fort taux de mutation lors de la réparation de l'ADN.

Particularité du milieu de culture:
Certaines substances nécessitent un inducteur pour être mutagène.
un extrait de foie de rat appelé S9 Mix (fraction microsomale) obtenu par ultracentrifugation est souvent ajouté à l'agar mou avant étalement. Cet extrait enzymatique convertirait les substances cancérogènes en dérivés électrophiles, plus susceptibles de réagir directement avec l'ADN, système absent chez les bactéries mais présent chez les mammifères. Ainsi de nombreux agents cancérogènes comme les aflatoxines ne deviennent actifs dans ce test qu'en présence de cet extrait de foie.

Avantages:

méthode simple, sensible et précise.
Ce test peut également s'appliquer à l'analyse d'effluents industriels, d'eau à usage alimentaire, de fumées ou de gaz d'échappement, de liquides biologiques humains (urines, fécès) provenant d'individus mis en contact par leur travail avec des produits cancérogènes. Les médicaments  et leur principe actif  peuvent aussi faire l'objet d'un examen systèmatique par ce test.

 

Inconvénient:


Ce test utilise des bactéries. Celles-ci ne présentent pas un modèle parfait  pour l'homme.


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Les fluides cryogéniques

18 Novembre 2009 Publié dans #hygiène et sécurité

L'utilisation des fluides cryogéniques (air, azote, oxygène, argon, hélium néon, hydrogène), nécessite du matériel adapté, résistant à l'action du gaz et aux basses températures.

Les transferts de fluides cryogéniques seront réalisés par siphonnage chaque fois que les conditions opératoires le permettront.

Pour les fluides cryogéniques dont l'évaporation est permanente (air, azote, oxygène, etc.), on ménagera un orifice d'échappement en vérifiant fréquemment qu'il n'est pas obstrué.

leur emploi fait apparaître des risques:
 
  • d'incendie: certains liquides cryogéniques sont très inflammables comme l'hydrogène, le méthane, l'acétylène.
  • d'explosion: les fluides cryogéniques oxydants tes que l'oxygène, l'air liquide, peuvent entraîner des réactions violentes en présence de substances réductrices. L'azote ou l'argon liquides, laissés au contact de l'air, s'enrichissent en oxygène qui peut être dangereux lors du réchauffement.
  • de lésions corporelles: le contact avec la peau ou les muqueuses notamment les yeux, peut provoquer des brûlures graves comparables aux brûlures thermiques.
  • d'intoxication: la plupart des fluides cryogéniques ne sont pas ou peu toxiques.

Consignes d'utilisation des fluides cryogéniques:
 
  • Garder en permanence des lunettes de protection avec des coques latérales et, si possible, se placer derrière un écran.
  • Vérifier la qualité du matériel, notamment la verrerie en contact avec le fluide cryogénique.
  • Bien maintenir le conteneur à refroidir (vase Dewar) dans une enveloppe protecrice stable et solide.
  • Porter des gants.
  • Pour les grandes quantités, vérifier la ventilation du local.
 
Propriétés des fluides cryogéniques
Gaz Point d'ébullition (°C) Volume d'expansion du gaz Toxicité
Acétylène -84 - +
Acide chlohydrique -85 - +
Azote -195 696 à 1 -
Argon -185 847 à 1 -
Dioxyde de carbone -78 553 à 1 +
Hélium 3 -269 757 à 1 -
Hélium 4 -268 757 à 1 -
Hydrogène -252 851 à 1 -
Méthane -161 578 à 1 -
Monoxyde de carbone -192   ++
Oxygène -183 860 à 1 -
Trifluorure de bore -100   +
 
Information sur l'utilisation des fluides cryogéniques:
 
  • Mise en place de panneaux de signalisation indiquant la présence de fluides cryogéniques et le risque d'asphyxie dans les locaux possédant l'installation cryogénique.
Panneau de signalisation pour la présence de fluides cryogéniques








 
Panneau de signalisation avertissant le risque d'asphyxie







 
  • L'utilisation des installations cryogéniques doit se faire par une personne qualifiée. Il devra suivre régulièrement une formation sur les régles de sécurités et les risques liés à l'utilisation des fluides cryogéniques.
 
L'instruction de sécurité IS 47 "Utilisation des fluides cryogéniques" contient des informations sur les systèmes mettant en oeuvre des fluides cryogéniques, les risques qu'ils présentent et les règles de sécurité appliquables. Il est publié par la division de l'inspection technique et de la sécurité (TIS) du CERN (Organisation européenne pour la recherche nucléaire). 
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Règles de sécurité dans l'utilisation de produits hautement mutagènes ou cancérogènes

17 Novembre 2009 Publié dans #hygiène et sécurité

Généralités:

Compte tenu des connaissances actuelles, il semble que la survenue d'un cancer chez l'homme résulte de la confluence de multiples facteurs:
  • D'un terrain propice:
génétique (rôle de l'hérédité), social (habitudes de vie, habitudes alimentaires, etc), individuel (maladie, stress récent).

  • D'un facteur cancérogène:
chimique, physique (UV RX, produits radioactifs...), viral et d'autres facteurs actuellement inconnus.

Dans la grande majorité des cas:

  • L'influence du facteur cancérogène nécessite une répétition prolongée de l'exposition.
  • Le délai d'apparition de la lésion est souvent très long ( 10 ans et même 30 ans dans le cas de l'amiante) après cessation de l'exposition.
  • En général, un même toxique produira plutôt une même lésion (notion d'organe-cible: mésothéliome pour l'amiante, leucémie pour le benzène, cancer de la vessie pour la benzidine...).


Règles de sécurité pour la manipulation des produits purs.

Les locaux:
une pièce sera spécialement aménagée pour les stockages, les pesées, les dilutions et les destructions des produits purs. Cette pièce, ainsi que les meubles servant au stockage ( réfrigérateur, armoires) seront balisés de l'indication "mutagènes".
Elle sera nettoyée après chaque usage par les utilisateurs. En dehors des manipulations, ce local sera fermé à clef. Il  sera interdit d'introduire dans ce local nourriture, boissons, ustensiles pour fumer, se maquiller, des sacs à main, mouchoirs en tissu, ....

Prévention collective:
Le nom des manipulateurs est noté et affiché sur la porte, avec la date et le produit utilisé.
Les manipulations doivent se faire dans une enceinte de préférence hermétique. A defaut, on pourra manipuler ces produits dans une sorbonne munie d'un filtre à charbon actif et raccordée à une gaine d'exraction indépendante. Le plan de travail sera recouvert de papier de type benchkote.

Prévention individuelle:
Une blouse jetable réservée à cette manipulation sera disponible sur place.
On doit utiliser masques et gants. pour la nitrosamines en particulier, utiliser 2 paires de gants jetables (latex et vinyl).

Destruction:
La destruction des déchets et le nettoyage des matériels pollués (papiers, gants, masque, pipettes, feuilles d'aluminium, etc;) sont effectués sur place par immersion dans un bain de permanganate de potassium en milieu acide (acide sulfurique concentré + solution saturée de KMnO4: délai d'action 3 heures).
Aucun résidu de produits purs ne doit sortir du local.

Accident:
En cas de dispersion du produit mêm dilué, on répandra une solution de permanganate de potassium en milieu acide, qu'on laissera en place 24h avant de procéder au nettoyage qui sera effectué par les manipulateurs ( et non par le personnel de service). Si nécessaire, changer de vêtements, les décontaminer dans le permanganate.
Se laver abondamment sur place.
Toujours prévenir le servie de médecine du travail (des dosages urinaires ou sanguins pourrontêtre mis en oeuvre dans certains cas).

Préparations diluées:

Les préparations diluées pourront sortir du local dans des récipients bouchés, contenus dans une boîte métallique fermée, portant le nom du produit et la mention "mutagène".
Chaque fois que possible, on ajoutera aux solutions un colorant type éosine, afin que toute pollution fortuite soit détectée.

Surveillance médicale:
La contamination peut survenir par inhalation des poussières, des vapeurs ou des aérosols, absorption cutanée ou ingestion fortuite. il conviendra donc de se protéger par un matériel adapté.
Adresser au service de médecine du travail toute personne affectée à ce travail, même pour une courte durée;
Les femmes enceintes seront éloignées de ce poste de travail.




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La cytométrie en flux (CMF)

16 Novembre 2009 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:

 

En 1934Moldavan, à Montréal, conçut le premier appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires en faisant défiler les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo électrique.

 


En 1945, W Coulter a mis au point un appareil permettant de compter des cellules et de mesurer leur taille par variation de résistivité du courant liquidien.

 


En 1953, Crosland-Taylor utilise un système d'injection de l'échantillon dans un flux laminaire (système décrits par Reynolds en 1883).

 


En 1965, Kamentsky permet une avancée en permettant l'analyse de 2 constituants cellulaires (DNA/protéine).

 


En 1969, Dan villa utilise le laser comme source lumineuse  car il permet une meilleure focalisation du faisceau, une grande puissance d'excitation et une stabilité du chromatisme.

 


Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales.

 

Premier cytométre commercialisés.


Dans les années 80, on peut entreprendre l'analyse de 3 paramètres de fluorescence par cellule.

 


Dans les années 90, on peut entreprendre l'analyse de 7 paramètres de fluorescence par cellule.

 


En 2001, on peut entreprendre l'analyse de 11 paramètres de fluorescence par cellule.

 


En 2006, on peut entreprendre l'analyse de 18 paramètres de fluorescence par cellule.

 


 
Principe:

 

La suspension cellulaire à analyser est injectée sous pression au centre d'une gaine liquide préssurisée. Les cellules vont être contraintes de s'y centrer et vont ainsi traverser individuellement le faisceau laser focalisé sur l'axe du jet. Les méthodes de mesure sont basées sur l'absorption et la diffusion du rayon laser par la cellule, la fluorescence émise par les flurochromes fixés et la forme du signal détecté.


  • La cellule, après interception de la lumière incidente (rayon laser) réemet dans divers directions une partie de la lumière sous forme de signaux représentatifs  de la taille et de la granulosité de la cellule. Il est ainsi possible par exemple de distinguer les lymphocytes, des monocytes et des polynucléaires, de différencier les cellules vivantes des cellules en apoptose et de mettre en évidence la phagocytose.


  • L'émission de fluorescence peut être spontanée mais le plus souvent apporté à la cellule par un ou plusieurs fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée sous forme de photons d’une longueur d’onde plus élevée. Elle permet de renseigner sur les propriétés cellulaires. Il est ainsi possible de réaliser des mesures d'ADN, d'ARN, de protéines, de calcium. Associé à un anticorps ou à un ligand spécifique, le fluorochrome  permet de quantifier et de réaliser une étude fonctionnelle de récepteur à la surface cellulaire.


Les signaux ainsi émis sont focalisés, séparés par une alternance de miroirs et de filtres optiques, en fonction de leur longueur d'onde. Ils sont ensuite amplifiés et transformés en impulsions électriques par les photomultiplicateurs puis digitalisés pour être utilisés par l'unité informatique.

 

La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement des sous populations définies par leurs propriétés optiques à partir d'une population hétérogène.

Le tri cellulaire permet de purifier d'éliminer des cellules mortes d'une culture et de faire du clonage en plaçant une cellule par puits dans une plaque de culture.

 


Avantages:

  • Etude quantitative de nombreuses caractéristiques (présence d'un antigène, quantité d'ADN ou d'ARN, activité enzymatique etc...).
  • Analyses précises sur des critères très différents et très nombreux.
  • Séparation des cellules avec une très grande pureté en condition stérile.
  • N'abime pas les cellules.


Inconvénients:

  • Les cellules doivent être en suspension.
  • Le nombre de cellules doit être de l'ordre de quelques centaines de milliers au minimum.
  • Pas d'image des cellules analysées.
  • L'analyse étant qu'à un unique instant donné, on ne peut pas faire de véritable étude cinétique portant sur une même cellule.


Principaux secteurs utilisant cette technologie:

Hématologie
Cancérologie
Immunologie
Pharmacologie
Océanographie
Physiologie végétale

  Intérêts d'application:

  • Analyse de constituants ou compartiments cellulaire: ADN, ARN, protéines, expression d'antigénes (membranaires ou intracellulaires), enzymes, hormones.
  • Analyse d'activités cellulaire (modification du pH, du Ca2+), métabolisme oxydatif, potentiel membranaire.


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Les prions

14 Octobre 2009 Publié dans #hygiène et sécurité

Le terme "prion" a été introduit par Stanley Prusiner en 1982  (chercheur américain).Le prion est une protèine anormale.
Les prions dont l'existence était naguère contestée sont aujourd'hui reconnus comme des agents responsables de diverses maladies infectieuses et génétiques (maladie de Creutzfeldt-Jacob, maladie de Kuru, tremblante du mouton, maladie des vaches folles...) pour lesquelles il n'existe pas à l'heure actuelle de solution thérapeutique.
D'autre part, il est impossible de diagnostiquer les maladies avant la phase clinique et les méthodes de décontamination classiques (alcool, formol, UV) sont inefficaces.


Types de confinement:

En fonction des connaissances actuelles sur le sujet, il est recommandé de travailler en confinement L3 avec des PSM de type II et en respectant les bonnes pratiques de laboratoire.

Pour la décontamination, il est actuellement proposé:

des traitements à
  • L'eau de javel: fraîchement diluée au 1/2, pendant 60mn,
  • NaOH pendant 60mn,
  • l'autoclavage à 138°C pendant 20mn,
  • le four Poupinel à 185°C pendant 2 heures.

de passer les pièces anatomiques formolées à l'acide formique pendant 1 heure avant l'autoclaver,
de faire tremper les instruments dans un bain d'eau de javel avant le traitement à la chaleur.
Aucune de ces méthodes ne constitue une  garantie absolue.

Les déchets seront, avant d'être incinérés, obligatoirement décontaminés par traitement à l'eau de Javel ou à la NaOH puis autoclavage.
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les milieux sélectifs en microbiologie

30 Septembre 2009 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Définition:

Un milieu sélectif est une milieu qui permet de sélectionner le type de bactéries qui pourront pousser sur celui-ci, alors que tous les autres micro-organismes présents sont inhibés. Un milieu de culture est rendu sélectif pour une espèce microbienne lorsque sont seules satisfaites les exigences nutritives et les conditions de développement particulières à cette espèce. Les principaux facteurs de sélection microbienne utilisés seuls ou en association sont:
  • La température d'incubation
  • Le pH du milieu
  • La faculté d'utiliser une source nutritive déterminée (azote, carbone)
  • La résistance à l'action bactéricide d'un antiseptique ou d'un antibiotique

Le milieu Chapman:

Son pouvoir  inhibiteur est obtenu par de fortes concentrations de Chlorure de sodium (7,5% ou 75g L-1) qui sélectionnent les micro-organismes halophiles parmi lesquels figurent les Staphylococcus, mais aussi les Micrococcus, les enterococcus, certains Bacillus, certaines Levures et même de rares bacilles gram-.

Composition d'un litre de milieu:

  • Peptone 10g
  • Extrait de viande de boeuf 1g
  • Chlorure de sodium 75g
  • Mannitol 10g
  • Rouge de phénol 0,025g
  • Agar-Agar 15g
  • Eau distillée qsp 1litre
  • pH = 7,4


Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du mannitol comme source de carbone et d'énergie.
Il est mis en évidence grace à un indicateur coloré de pH: le rouge de phénol.

  • Si le milieu reste rouge, les colonies sont mannitol- car elles ne fermentent pas le mannitol, légère alcalinisation du milieu par l'utilisation de peptones dans leur métabolsime énergétique.
  • Si le milieu devient jaune, les colonies sont mannitol+ car elles fementent le mannitol dans leur métabolisme énergétique avec acidification du milieu.



Le milieu EMB (milieu éosine bleu de méthylène):
Ce milieu est utilisé pour isoler et identifier Escherichia coli et Enterobacter ainsi que les bactéries intestinales à Gram -.

Histoire:

En 1916, HOLT-HARRIS et TEAGUE employèrent une association d’éosine et de bleu de méthylène pour différencier les microorganismes suivant leur aptitude à fermenter ou non le lactose. Le saccharose compris dans le milieu permettait de détecter les coliformes qui fermentaient celui-ci plus rapidement que le lactose. Par la suite, Levine modifia la formule en supprimant le saccharose et en augmentant le concentration en lactose ; ce qui permit de différencier aisément Escherichia coli et Enterobacter aerogenes.

Préparation pour 1 litre de milieu:


  • peptone pancréatique de gélatine : 10 g
  • phosphate dipotassique (PO4 K2H) : 2 g
  • lactose : 10 g
  • éosine jaune : 0,4 g
  • bleu de méthylène : 0,065 g
  • agar agar : 15 g
  • pH: 6,8
le bleu de méthylène et l'éosine jaune sont deux colorants inhibiteurs partiels des bactéries Gram + tel que les enterocoques. Ces colorants assurent la différenciation entre les germes lactose + et les germes lactose -.

Lecture:

Escherichia coli:
Colonies violet foncé; bombées faiblement confluentes, de 2 à 3 mm de diamètre, à centre noir étendu à plus des 3/4 du diamètre et qui présentent un éclat métallique verdâtre en lumière réfléchie.

Enterobacter aerogenes:
Colonies bleuâtres à centre brun foncé, aplaties, plutôt confluentes, de 4 à 6 mm de diamètre qui ne présentent qu'occasionnellement un éclat métallique.

Citrobacter:
Colonies violettes à leger reflet métallique.

Klebsiella:
Colonies brunâtres, muqueuses.

Salmonella et shigella:
Colonies ambrées, transparentes.

Produits contrôlés par ce milieu:

  • Produits pharmaceutiques
  • Produits laitiers et alimentaires
  • eaux

La gélose Salmonella-Shigella (S.S.):

La gélose Salmonella-Shigella (S.S.) est utilisé pour l’isolement sélectif des Salmonella et des Shigella dans les prélèvements cliniques (selles) et les denrées alimentaires.

 

Préparation pour un litre d'eau distillée ou déminéralisée:

 

Protéose peptone

5 g


Citrate ferrique ammoniacal

 1 g

Extrait de viande de bœuf

5 g


Thiosulfate de sodium

8,5 g

Lactose

10  g


Rouge neutre

0,025 g

Sels biliaires N° 3

8,5 g


Vert brillant

0,00033 g

Citrate de sodium

8,5 g


Agar

13,5 g

 

pH final à 25°C : 7,0 ± 0,2

 

  • les agents inhibiteurs sont les sels biliaires, le vert brillant et le citrate de sodium. Ils empéchent la pousse de toutes bactéries Gram+ et rendent difficile la croissance des bactéries Gram- autre que Salmonella et Shigella.
  • Le milieu contient du thiosulfate pouvant donner du H2S. Celui-ci est révélé par le citrate ferrique.
  • Le milieu contient du lactose pouvant être fermenté. La fermentation est révélée par le virage de l'indicateur coloré, le rouge neutre à sa teinte acide.
  

Lecture:

 

Les colonies caractéristiques de Salmonella (lactose négatif) sont opaques, translucides ou transparentes et généralement avec un centre noir (H2S positif).

Les colonies caractéristiques de Shigella (lactose négatif) sont incolores.

 

Les coliformes qui réussissent à pousser sur ce milieu sont rose-rouge (lactose positif).




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Classes de confinement pour les laboratoires microbiologiques

25 Mars 2009 Publié dans #hygiène et sécurité

CLASSE DE CONFINEMENT 1 (L1):
  • Concerne les micro-organismes non génétiquement modifiés de classe1 (n'ayant aucun pouvoir pathogène pour l'homme et ne constituant pas une menace pour l'environnement).
  • Concerne les micro-organismes non pathogènes génétiquement modifiés portant des fragments d'ADN étranger sans pouvoir pathogène.
  • Concerne les cellules animales et végétales normales ou immortalisées et plantes transgéniques ne reproduisant pas de virus ou ne produisant que des virus de classe1, Ea1 ou Ep1.


CLASSE DE CONFINEMENT 2 (L2):

  • Concerne les micro-organismes non génétiquement modifiés de classe 2 (qui peuvent provoquer des maladies chez l'homme mais dont la dissémination dans l'environnement est peu probable, qui sont sans risque pour la collectivité et contre lesquels une prophylaxie ou des traitements efficaces sont connus).
  • Concerne les micro-organismes génétiquement modifiés de classe 2 dans lesquels les vecteurs ou les séquences clonées n'augmentent pas la classe de risque.
  • Concerne les micro-organismes non pathogènes ou de classe 1 génétiquement modifiées portant, soit des gènes codant  pour des protéines ayant un pouvir pathogène limité, soit des fragments importants de génome de micro-organismes de classe 2, Ea2 ou Ep2.
  • Concerne les cellules animales exprimant un virus de la classe2 ou Ea2.
  • Concerne les cellules animales abritant des vecteurs d'expression qui contiennent des gènes codant pour des proétéines ayant un pouvoir pathogène limité ou des fragments de génomes humains ou animaux  inconnus ou des fragments importants de génomes  de micro-organismes de classe 2 ou Ea2.
  • concerne les cellules végétales et plantes transgéniques produisant des virus de classe Ep2.

CLASSE DE CONFINEMENT 3 (L3):

  • Concerne les micro-organismes non génétiquement modifiés de classe 3 (ayant un pouvoir pathogène important chez l'homme mais présentant un risque mineur pour la collectivité et contre lesquels une prophylaxie ou des traitements efficaces sont connus).
  • Concerne les micro-organismes génétiquement modifiés de classe 3 dans lesquels les vecteurs ou les séquencs clonés n'augmentent pas la classe de risque.
  • Concerne les micro-organismes non pathogènes ou de classe 2 génétiquement modifiés portant, soit des gènes codant pour des protéines ayant un pouvoir pathogène important pour l'homme, soit des fragments importants de génomes de micro-organismes de classes 3 ou Ea3.
  • Concerne les cellules animales exprimant des virus de classe 3 ou Ea3.
  • Concerne les cellules animales abritant des vecteurs d'expression qui contiennent des gènes codant pour des protéines ayant un pouvoir pathogènes pour l'homme ou des fragments importants de génomes de micro-organismes de classe 3 ou Ea3.
  • Concerne les cellules végétales et plantes transgéniques produisant des virus de classe Ep3.

CLASSE DE CONFINEMENT 4 (L4):

  • Concerne les micro-organismes non génétiquement modifiés de classe 4 (ayant un très fort pouvoir pathogène chez l'homme et présentant une menace pour la collectivité et contre lesquels aucune prophylaxie ou traitement ne sont connus).
  • Concerne les micro-organismes génétiquement modifiés de classe 4.
  • Concerne les micro-organismes non pathogènes de classe 2 ou 3 génétiquement modifiés portant des fragments importants de génomes entiers de micro-organismes de classe 4.
  • Concerne les cellules animales exprimant des virus de classe 4.
  • Concerne les cellules animales abritant des vecteurs d'expression qui contiennent des fragments importants de génomes entiers de micro-organismes de classe 4.


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Bonnes pratiques dans un laboratoire L1

25 Mars 2009 Publié dans #hygiène et sécurité

  • Connaissance:
  • des désinfectants, des prétraitements des déchets et de leur élimination,
  • des risques, du matériel et des produits utilisés,
  • des consignes de sécurité,
  • de la conduite à tenir en cas d'accident.
  • Il est interdit de manger, boire, fumer, se maquiller dans le local.
  • Ne pas décapsuler les crayons feutres avec les dents.
  • Les plans de travail doivent être désinfectés avant et après la manipulation et après une contamination.
  • Se laver les mains avant et après la manipulation.
  • Port de bouse obligatoire.
  • Port de gant si nécessaire.
  • Dans la mesure du possible utiliser du matériel jetable, éviter l'usage d'aiguilles hypodermiques et de matériel en verre.
  • Les aiguilles et matériels coupants seront récupérés dans une boîte spéciale (ne pas recapuchonner les aiguilles).
  • Ne pas pipeter à la bouche, utiliser un système d'aspiration mécanique.
  • Eviter la création d'aérosols et de projections:

    • une suspension de micro-organismes ne doit jamais être mélangée par aspirations et refoulements successifs à travers une pipette et chassée brutalement.
    • Il est recommandé de faire s'écouler les liquides le long de la paroi intérieure du tube en dessous de la surface du liquide contenu dans le récipient.

  • Pour éviter les accidents dus aux gouttes de culture microbienne qui tombent accidentellement, il est possible de mettre sur le plan de travail un support absorbant imprégné de désinfectant qui sera après utilisation détruite par autoclavage.
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Transfert de gène dans les cellules eucaryotes

23 Mars 2009 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

L'étude des fonctions d'un gène passe par 3 étapes différentes:
  • Isolement , clonage et séquençage du gène,
  • manipulation in vitro sur le gène provoquant des mutations,
  • réintroduction du gène modifié dans les cellules pour étudier sa fonction. On qualifie cette réintroduction sous le terme de transfection cellulaire.

L'intérêt d'étudier la fonction d'un gène est multiple:

permet d'identifier des séquences régulatrices (emplificateur),
La thérapie génique.

Les obstacles à une telle étude sont:


Les cellules de mammifères sont refractaires à la transfection. On a de très faibles pourcentages de cellules transfectées.
les cellules normales n'ont pas une tendance à se multiplier à haute fréquence. Ce dernier fut résolu grâce aux lignées cellulaires qui possèdent la particularité de se multiplier rapidement et indéfiniment. ces cellules dérivent de lignées tumorales. Elle présentent néanmoins des propriétés différentes aux cellules normales.
On peut également utiliser des cellules immortalisées.  Ce sont des cellules normales traitées de façon qu'elles se multiplient rapidement.

Différents types de traitement pour immortaliser les cellules:


  • Par un oncogène,
  • Par un virus (polyome, SV40, virus du Sarcome de Rous, virus d'Epstein-bar...).
  • Par un produit chimique tel qu'un agent mutagène (nitrosoguanidine, méthanesulfonate d'éthyl...).

Le transfert de gènes:


On peut utiliser des virus tumorigènes qui infectent les cellules de mammifères. Ils s'intégrent dans le génome de ces cellules et détournent la machinerie cellulaire à leur profit. En effet, du fait de leur simplicité extrême, les virus ne peuvent pas se multiplier, du moins se multiplier par eux-mêmes. Pour éviter la lyse cellulaire, on veillera à ce que le génome virale s'intégre au génome de la cellule. La cellule deviendra ainsi tumorale.Le virus sert de vecteur au gène d'intérêt en l'incorporant dans le gènome de celui-ci.

La technologie faisant appel à l'utilisation d'ADN recombinant, de plasmide et d'enzyme de restriction. Dans cette voie, les cellules étaient réfractaires à l'introduction de plasmide. De nombreux laboratoires ont essayé de faciliter l'introduction par différentes méthodes:

  • L'électroporation: les cellules sont soumis à un champ électrique. Les impulsions électriques produisent un potentiel transmembranaire provoquant une rupture réversible de la membran cellulaire. Des pores se forment et permettent au plasmide de pénétrer dans la cellule.

  • La micro-injection directe de l'ADN grâce à des micro-pipettes. Cette méthode est lourde à entreprendre  sachant qu'un fragment d'ADN doit être injecté dans 100 cellules eucaryotes.

  • Association de l'ADN et d'une colonne DEAE (diéthylaminoéthyl). Ce géle montre des charges positives permettant de fixer l'ADN (chargé négativement). On introduit ensuite les cellules dans cette colonne et on provoque un choc thermique. Des pores apparaissent dans la membrane plasmique de ces cellules permettant l'introduction de l'ADN. Beaucoup de cellules sont réfractaires à ce système.
  • Utilisation du phosphate de calcium: l'ADN étranger se trouve en solution avec du phosphate de calcium. Cet ADN va alors co-précipiter avec les cristaux tricalciques, et ainsi être protégé des nucléases. De plus cette précipitation à l’avantage d’augmenter le contact avec les cellules cibles. Ce contact entre la cellule et le co-précipité va induire une endocytose, et ainsi permettre l’introduction de l’ADN étranger dans la cellule cible. Cette technique est relativement simple à réaliser. Son rendement est bon mais elle acidifie le milieu de culture, et peut être toxique à plus ou moins long terme.

  • Utilisation de liposomes qui sont des vésicules artificielles formées par des bicouches phospholipidiques. Ils mesurent quelques dizaines à quelques milliers de nm de diamètre. L'association avec l'ADN se fait par interaction électrostatique entre les groupes phosphates de l'ADN chargés négativement et les têtes polaires des lipides cationiques chargées positivement. On obtient un vecteur  qui au contact des cellules, pénétre dans celles-ci. La pénétration intracellulaire  reste pour le moment mal connue. En dehors de l'endocytose, d'autres mécanismes semblent possibles. Dans le cytoplasme de la cellule, le liposome se dissocie, libérant l'ADN. L'utilisation des liposomes présente des inconvénients importants, le rendement faible de la pénétration intracellulaire et dans le noyau (transfection stable).

Identification des cellules transfectées:

Dans le cas de la transfection par le biais d'un virus:
Les cellules eucaryotes infectées par un virus sont facilement observables car elles produisent des particules virales.

Dans le cas d'une transfection par le biais d'un plasmide:
L'utilisation d'un plasmide pour la transfection cellulaire rend impossible l'identification des cellules ayant reçu la tranfection sachant que le taux de réussite est très faible. Pour répondre à ce problème, nous utilisons une partie du génome du virus de l'herpès ( HSV pour Herpes Simplex Virus), et plus particulièrement le gène TK qui code pour la thymidine kinase (enzyme qui phosphoryle la thymidine). Cette enzyme est indispensable pour la réplication des virus.
Ce gène est associé au gène de la beta globine servant de site de restriction pour l'enzyme KPN1.
L'ensemble est ensuite mis en contact avec des cellules  déficientes pour le gène TK  (paramétre limite) et en présence de phosphate de calcium (transfection cellulaire).
Les cellules poussent dans un milieu sélectif. Seules les cellules possédant le gène TK poussent c'est à dire les cellules transfectées.On obtient des clones que l'on sépare. On procède ensuite a l'extraction de l'ADN de ces clones.
L'ADN ainsi prélevé, on procède à sa digestion en utilisant l'enzyme de restriction  KPN1 qui coupe au niveau du gène de la globine. On obtient des fragments d'ADN. Ceux-ci sont séparés par électrophorèse puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. On procède enfin à l'hybridation moléculaire en utilisant une sonde radioactive de la beta globine (technique du southern blot).
Cette technique ne s'adresse qu'aux cellules  déficientes pour le gène TK.

Le marqueur génétique idéal doit permettre de sélectionner un caractère génique qui s'exprimera dans toutes les cellules choisies. Le gène marqueur aph (aminoglycoside phosphotransférase) est un gène bactérien qui confère la résistance à une substance apparentée à la néomycine, le G418 (généticine) qui tue les cellules de mammifères en bloquant la synthèse protéique. Ce gène code pour une enzyme qui détruit cette substance.
On crée un plasmide avec le gène aph, le gène d'intérêt et un promoteur. Ce plamide est ensuite mis en contact avec les cellules en culture. Le plamide pénétre dans quelques cellules. La transfection peut soit être stable ou transitoire.

  • Dans le cas d'une transfection stable, les rares cellules transfectées qui intégrent l'ADN exogène dans leur génome sont selectionnées sur un milieu contenant du G418 (les autres cellules non transfectées meurent). Ces cellules ayant subi une transfection stable continueront à produire la protéine codée par l'ADNc tant que la culture sera maintenue.
  • L'obtention des transfectants stables n'est pas toujours évident d'où le passage à des transitoires. Dans ce cas là, on ne laisse pas le temps au plasmide de s'intégrer au génome. On lyse les cellules et on récupére leur contenu.
  • En 48 heures de culture, on a suffisament d'ARN synthétisé par le gène exogène.
La transfection transitoire permet d'étudier les ARN ou les protéines  traduitent à partir de ces ARN.
Il convient d'utiliser un vecteur d'expression efficace. Il doit contenir:
  • Un gène de la résistance à l'antibiotique à l'ampicilline.
  • Un promoteur puissant comme le promoteur du gène précoce du cytomégalovirus humain (CMV).
  • Un gène d'intérêt intégré au niveau du polylinker.
  • Une séquence de meilleur arrêt de transcription.
  • Un séquence de meilleur traduction.
  • Une séquence intronique ( utilisée par la machinerie cellulaire lors de la maturation) afin d'assurer une meilleure transcription.
La transfection transitoire permet d'étudier le taux d'expression d'un gène.
L'expression d'un gène dépend de son promoteur. Si le promoteur n'est pas fort, la transcription reste difficile à détecter.
A ce promoteur faible, on ajoute un gène rapporteur ("reporter"). Quand le gène rapporteur sera exprimé en ARNm puis traduit en protéine, cette dernière sera facilement détectable par des tests. On pourra déterminer le taux de la protéine et donc en déduire la force du promoteur.

Exemple de gène rapporteur:
Le gène CAT (Chloremphenical Acetyl Transférase). Ce gène code pour une enzyme qui transfecte l'acétyl sur le chloremphenical.
Le plasmide possédant le promoteur a étudier et le gène rapporteur  est mis en contact avec les cellules en culture. Après 48h, on lyse les cellules par des cycles de congélation/décongélation. Ces lysats sont ensuite mélangés avec du chloramphenical  radioactif et de l'acétyl coenzyme A. L'enzyme Chloremphenical Acetyl Transférase transfére le groupe acétylé de l'acétyl CoA sur les positions 2 ou 3 du chloramphenical. La réaction est suivie par chromatographie en couche mince qui permet de séparer le chloramphenical acétylé de la forme non acétylé. les formes de chloramphenical acétylé montent plus haut que la forme non acéthylé.
On visualise les produits de la réaction par autoradiographie.
on observe un seul signal correspondant au chloramphenical non acetylé traduisant que  le promoteur n'est pas actif et 3 signaux  correspondant aux 2 formes acétylés et la forme non acétylé du chloramphenical.
On notera que plus le signal autoradiographique est fort et plus la transcription est fort. Ceci traduit l'activité réelle du promoteur.

On peut également utiliser comme gène rapporteur, le gène de la luciférase. Il code pour une enzyme la luciférase qui  à la particularité d'
oxyder la luciférine (substrat) aboutissant à la formation d'oxyluciférine et à l'émission de photons. On utilisera dans ce cas, un appareil capable de détecter la bioluminescence.



L'amplification génétique:


La transfection stable peut
être également utilisée afin de réaliser de très nombreuses copies  du gène d'intérêt.
On réalise dans ce cas, un plasmide  comprenant le gène d'intérêt et le gène DHFR qui code pour le dihydrofotate réductase. C'est  une enzyme importante pour la réplication de l'ADN et donc pour la survie des cellules.
On transfecte ce plasmide dans des cellules DHFR-. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu dépourvu de nucléosides. Les cellules meurent sauf celles qui contiennent dans le génome, le gène DHFR et le gène d'intérêt (transfection stable). Des clones apparraissent. Ceux-ci sont récupérés puis mis en culture afin d'augmenter leur quantité. On dépose du méthotrexate
(inhibiteur de la DHFR) à faible dose  dans le milieu. Un grand nombre de cellule meurent. Les cellules qui ont pu résister sont remis en culture. L'analyse de l'ADN de ces cellules dévoile une amplification génétique du gène DHFR et des régions voisines dont le gène d'intérêt. On procéde à chaque étape de culture à l'augmentation progressive de la concentration du méthotrexate afin d'obtenir une succession de copie du gène DHFR et du gène d'intérêt.
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