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biotechnologie

La cytométrie en flux (CMF)

16 Novembre 2009 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:

 

En 1934Moldavan, à Montréal, conçut le premier appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires en faisant défiler les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo électrique.

 


En 1945, W Coulter a mis au point un appareil permettant de compter des cellules et de mesurer leur taille par variation de résistivité du courant liquidien.

 


En 1953, Crosland-Taylor utilise un système d'injection de l'échantillon dans un flux laminaire (système décrits par Reynolds en 1883).

 


En 1965, Kamentsky permet une avancée en permettant l'analyse de 2 constituants cellulaires (DNA/protéine).

 


En 1969, Dan villa utilise le laser comme source lumineuse  car il permet une meilleure focalisation du faisceau, une grande puissance d'excitation et une stabilité du chromatisme.

 


Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales.

 

Premier cytométre commercialisés.


Dans les années 80, on peut entreprendre l'analyse de 3 paramètres de fluorescence par cellule.

 


Dans les années 90, on peut entreprendre l'analyse de 7 paramètres de fluorescence par cellule.

 


En 2001, on peut entreprendre l'analyse de 11 paramètres de fluorescence par cellule.

 


En 2006, on peut entreprendre l'analyse de 18 paramètres de fluorescence par cellule.

 


 
Principe:

 

La suspension cellulaire à analyser est injectée sous pression au centre d'une gaine liquide préssurisée. Les cellules vont être contraintes de s'y centrer et vont ainsi traverser individuellement le faisceau laser focalisé sur l'axe du jet. Les méthodes de mesure sont basées sur l'absorption et la diffusion du rayon laser par la cellule, la fluorescence émise par les flurochromes fixés et la forme du signal détecté.


  • La cellule, après interception de la lumière incidente (rayon laser) réemet dans divers directions une partie de la lumière sous forme de signaux représentatifs  de la taille et de la granulosité de la cellule. Il est ainsi possible par exemple de distinguer les lymphocytes, des monocytes et des polynucléaires, de différencier les cellules vivantes des cellules en apoptose et de mettre en évidence la phagocytose.


  • L'émission de fluorescence peut être spontanée mais le plus souvent apporté à la cellule par un ou plusieurs fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée sous forme de photons d’une longueur d’onde plus élevée. Elle permet de renseigner sur les propriétés cellulaires. Il est ainsi possible de réaliser des mesures d'ADN, d'ARN, de protéines, de calcium. Associé à un anticorps ou à un ligand spécifique, le fluorochrome  permet de quantifier et de réaliser une étude fonctionnelle de récepteur à la surface cellulaire.


Les signaux ainsi émis sont focalisés, séparés par une alternance de miroirs et de filtres optiques, en fonction de leur longueur d'onde. Ils sont ensuite amplifiés et transformés en impulsions électriques par les photomultiplicateurs puis digitalisés pour être utilisés par l'unité informatique.

 

La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement des sous populations définies par leurs propriétés optiques à partir d'une population hétérogène.

Le tri cellulaire permet de purifier d'éliminer des cellules mortes d'une culture et de faire du clonage en plaçant une cellule par puits dans une plaque de culture.

 


Avantages:

  • Etude quantitative de nombreuses caractéristiques (présence d'un antigène, quantité d'ADN ou d'ARN, activité enzymatique etc...).
  • Analyses précises sur des critères très différents et très nombreux.
  • Séparation des cellules avec une très grande pureté en condition stérile.
  • N'abime pas les cellules.


Inconvénients:

  • Les cellules doivent être en suspension.
  • Le nombre de cellules doit être de l'ordre de quelques centaines de milliers au minimum.
  • Pas d'image des cellules analysées.
  • L'analyse étant qu'à un unique instant donné, on ne peut pas faire de véritable étude cinétique portant sur une même cellule.


Principaux secteurs utilisant cette technologie:

Hématologie
Cancérologie
Immunologie
Pharmacologie
Océanographie
Physiologie végétale

  Intérêts d'application:

  • Analyse de constituants ou compartiments cellulaire: ADN, ARN, protéines, expression d'antigénes (membranaires ou intracellulaires), enzymes, hormones.
  • Analyse d'activités cellulaire (modification du pH, du Ca2+), métabolisme oxydatif, potentiel membranaire.


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