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biotechnologie

La PCR

25 Février 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

Présentation de la PCR:

cette technique fut imaginée par le scientifique américain Karry Bank Mullis et développée par le Dr H.A. Herlich avec la collaboration de la compagnie Cetus en 1985.

La PCR ou Polymérase Chain Reaction conduit à l'amplification in-vitro de plusieurs millions de fois une séquence spécifique d'acide nucléique qui peut être minoritaire voir très rare (10-2pg). Elle exploite le processus de la réplication et fait appel, pour cela, sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d'un ADN servant de matrice. Pour initier le processus, des amorces (ou primer) s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN polymérase de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de nouveaux ADN doubles brins.

La PCR s'effectue sur 3 étapes:

  • La dénaturation thermique de l'ADN: à 95°C, les liaisons d'hydrogènes sont rompues et les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme simple brin dans le milieu.
  • Hybridation des amorces: le milieu réactionnel contient 2 amorces, chacune complémentaire d'un des 2 brins. La température permettant la fixation des amorces sur les monobrins d'ADN est comprise entre 50°C et 65°C. Les amorces en larges excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires.
  • Extention des amorces: intervention de la taq polymérase (ADN polymérase) qui allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléiques complémentaires de la séquence de la matrice auquel elle est hybridée. Cette étape s'effectue à une température de 72°C.
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  • Au deuxième cycle: la quantité d'ADN continue de doubler et les premiers brins dont la taille est limitée par les 2 amorces font leur apparition.
  • Au troisième cycle: Les premiers amplicons apparaissent (ADN double brins borné par les amorces correspondant au fragment d'ADN recherché).

En théorie, après n cycles, on augmente le nombre d'ADN interressant  de 2n.
En pratique, le nombre de brins est limité à cause de la baisse de certains réactifs, l'augmentation de la viscosité du milieu et la baisse de l'activité de l'ADN polymérase thermostable.
A l'issue de la PCR, on obtient des fragments de même taille correspondant à la distance en base qui sépare les amorces
.

La technique PCR se réalise par le biais d'un appareil programmable appelé un thermocycleur dans lequel sont placés les microtubes contenant le mélange réactionnel. Cet appareil permet d'exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l'expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide, elle ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).

Composition du mélange réactionnel dans les microtubes:

Le mélange s'effectuera toujours sur la glace et les différents élèments qui le compose seront placés dans l'ordre suivant dans les microtubes:
H20, le tampon, MgCl2, les nucléotides, les amorces, l'enzyme ( taq polymérase) et enfin l'ADN à amplifier.
NB: on réalise toujours un témoin dans lequel l'ADN est remplacé par de l'eau (témoin négatif) afin de déceler une éventuelle contamination (
la contamination par de l'ADN précédemment amplifié représente le principal risque). Un témoin positif permettra de valider la bonne conservation des réactifs, de l'enzyme responsable de la polymération et des performances du thermocycleur. un témoin interne présent dans le milieu réactionnel renseignera sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de l'amplification.

Révélation des produits d'amplification:

Lorsque la quantité de produits d'amplification est suffisante, ceux-ci sont soumis à une électrophorèse  en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt (Bromure d'éthydium: produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques faisant apparaitre à la molécule d'ADN une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 30 nm)). La vitesse de migration étant dépendant de la masse de la molécule, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons peuvent être facilement vérifiable sur le gel.

Intérêts de la technique PCR:
  • La PCR peut être un outil très avantageux dans la détection de génes mutés responsables de cancers et de maladies génétiques.
  • Elle peut également être très utile pour le suivi des thérapies anticancéreuses et ainsi permettre au médecin de poursuivre ou pas le traitement.
  • Comme certains cancers  sont induits par translocation chromosomique, la PCR identifie la présence ou pas de réarengements chromosomiques  avec une sensibilité plus importante par rapport à d'autres techniques (elle peut ainsi détecter une cellule cancéreuse pour un million de cellules normales).
  • La PCR peut servir dans la détection d'infection virale ou bactérienne. Elle est utilisée dans l'identification du virus du SIDA.
  • La PCR peut intervenir dans l'étude concernant l'évolution des espèces. La divergence des espèces à partir d'un ancêtre commun est reflétée par le degré de divergence entre les séquences nucléotidiques des génes. La mesure de cette divergence nucléotidique peut être utilisée pour déterminer le lien de parenté entre différentes espèces.

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nkanga makuntima 27/02/2017 11:50

j'ai apprecié,je peus avoir cette technique en image etape par etape?

ness 05/04/2015 10:26

Bonjour , à quelle temperature , on doit conserver le Mix PCR ( le tampon, MgCl2, les nucléotides, l'enzyme (Taq polymerase ) ) ?

best argan oil 20/09/2014 07:56

Dans la médecine et de la psychologie, une définition moins spécifique du syndrome est utilisé, qui décrit un ensemble de symptômes et les résultats sans nécessairement les relier à un seul pathogenèse identifiable.

B&G Equipment 09/09/2014 13:29

I had studied about the PCR invention and development by Karry Mullis Bank and Dr. HA Herlich from my collage. I want to create a paper presentation of this subject. I want to know what will happen to this reaction if we applied this in reverse order.

Vaudry 09/04/2011 19:56



La Plate-Forme d’Imagerie PRIMACEN (http://primacen.crihan.fr) vient d’acquérir une plate-forme de PCR
quantitative Roche LightCycler® 1536 qui permet de traiter 1 536 échantillons dans un volume réactionnel final de 2 µl en moins de 50 minutes. Le LightCycler® 1536 a été choisi pour sa souplesse,
sa sensibilité et sa reproductibilité. PRIMACEN développe maintenant des séries d’amorces dirigées contre des familles de gènes afin de pouvoir étudier des voies métaboliques. Chaque série
contient des amorces dirigées contre 84 gènes d'intérêt, des amorces pour amplifier 7 gènes de ménage et un ensemble de 5 contrôles internes afin de valider les expériences. Chaque couple
d'amorces a été développé par nos soins et validé en terme de spécificité et d'efficacité. Bien que plusieurs formats soient disponibles, nos séries d’amorces ont été principalement développées
pour pouvoir analyser 16 échantillons d'ADNc simultanément. Une application internet est en cours de développement pour aider nos utilisateurs à analyser et à interpréter leurs
résultats.


Ce système va permettre de valider vos expériences de microarray, de réaliser l’étude d’un
processus cellulaire (apoptose, réponse inflammatoire, angiogenèse…), de rechercher des contaminants bactériens, d’analyser la toxicité cellulaire… Nous proposons déjà plusieurs panels sous forme
de prestations (cycle cellulaire, stress oxydatif, apoptose…) et recherchons actuellement des partenaires académiques et industriels intéressés par la technologie pour développer des panels
spécifiques dans des domaines par exemple de la toxicologie. Pour plus d’information, contactez David Vaudry (david.vaudry@univ-rouen.fr).