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biotechnologie

La culture cellulaire

6 Février 2008 , Rédigé par Magniez frédérick Publié dans #biotechnologies

Définitions:


On appelle culture d'organe, le maintien en dehors de l'organisme, d'organes ayant conservé leur structure et leur fonction (coeur perfusé).

On appelle culture de tissu, le maintien en dehors de l'organisme, des tissus de manière à conserver les fonctions spécifiques de chaque tissu.

On  appelle culture cellulaire, le maintien en dehors de l'organisme, des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro et d'exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques.

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photos de alysson @!@
cellule humaine en mitose

Histoire:


3 périodes vont marquer le développement de la culture cellulaire.


La période des précurseurs (1885, 1900). Cette période annonce la première méthode de culture de tissu en dehors du corps, grace au Professeur Ross Harrison  qui a pu cultiver des neuroblastes de grenouille dans un milieu de lymphe et ainsi franchit un premier pas vers la recherche actuelle sur les cellules souches et dérivées.

La période de la culture de tissus (à partir de 1902). Cette période est dominée par Alexis Carrel qui oriente le développement de la culture de tissus suivant 3 voies principales:
  • L'amélioration des techniques d'obtention des tissus.
  • L'élaboration des règles d'aseptie.
  • L'étude des besoins nutritionnels.

La culture cellulaire n'apparait proprement dit qu'à partir de 1952 lors de l'introduction de la trypsinisation des tissus par Moscona en 1952. Il procéde à la digestion de tissu d'oeuf de poulet avec de la trypsine afin d'obtenir des cellules isolées  ou des amas de cellules capables de se diviser in-vitro.

Les techniques d'obtention des cellules:

On distingue 2 types de cellules:
  • Les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang
  • Les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu.
Les techniques d'obtention de ces 2 classes de cellules sont différentes.
  • Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et centrifugation.
  • Les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en oeuvre de techniques plus originales qui peuvent être divisées en 2 groupes: la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique.
La méthode par dissection:

Cette méthode est la plus ancienne. Elle a permis aux précurseurs de la culture de tissu d'obtenir les premières cellules in-vitro.

La méthode de Carrel consiste à prélever un morceau de tissu qui est réduit en un très petit rectangle et déposé à la surface d'un mélange de 2 gouttes de plasma de coq et de 2 gouttes d'extrait embryonnaire à 50%. Après un séjour de 24H à l'étuve, on voit migrer les premières cellules à partir de l'explant.

La méthode de dissection consiste à couper en fragment d'environ 1 à 4 mm3  le tissu que l'on réduit encore à l'aide de pince. Ces fragments sont ensuite placés dans un flacon de culture contenant un milieu nutritif.  Les cellules vont migrer à partir des différents fragments puis se multiplier. Cette méthode s'appelle également la méthode des explants.

La méthode Jensen:

Cette technique est plus rarement utilisée.
Les fragments de tissus de 1 mm3 sont placés sur un disque de papier filtre qui repose sur un support métallique dans une boite de pétri . Les cellules qui prolifèrent à partir du fragment du tissu traversent les pores du papier et se fixent au fond de la boite. Cette technique donne l'avantage d'une séparation constante entre l'explant et les cellules migrantes évitant l'étape délicate de l'élimination de l'explant lorsque une couche subconfluente est obtenue.

La méthode mécanique:
Cette technique s'applique pour des tissus mous comme le thymus, la rate. Elle consiste à frotter le tissu sur une grille puis de filtrer et centrifuger. On peut également dilacérer les tissus à l'aide d'une pipette en verre en pipetant et refoulant les tissus.


La méthode par digestion enzymatique:

Les enzymes utilisées sont des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame protéique qui entoure les cellules. on utilise souvent la trypsine à une concentration de 0,5 à 2,5 g/l dans une solution saline.

Les avantages et les inconvénients de ces méthodes.
  • La méthode par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très petit. L'obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement long (environ 30 jours).
  • La méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode.
Les méthodes de culture:

La culture stationnaire ou monocouche:

Le principe général de cette méthode est lié à l'affinité des cellules au support car la plupart appartient à des tissus solides organisés.
Le support peut être du verre ou du plastique traité pour la culture. Le plastique peut être recouvert de support physiologique: collagène, fibronectine ou d'une membrane basale reconstituée ou encore l'utilisation de gèle d'agarose, de géle de collagène pour une orientation vers la culture 3D.undefined

Les cellules sont placées dans des boites micropuits de diamétres différents ou sur des microporteurs (microbilles en plastique) recouverts ou non de support physiologique. Les microporteurs sont ensuite placés dans des récipients puis soumis à une agitation modérée et continue permettant aux cellules de demeurer dans le milieu de culture. Le rendement de cette technique est importante. Cela étant dû à une surface d'adhérence plus grande.

La culture en suspension:

Comme la plupart des cellules ont besoin d'un support pour croître, il faut donc trouver un artifice pour maintenir la plupart de celles-ci en suspension.
En 1933, Monsieur Gey arrive à faire croître dans des tubes en verres, des cellules en suspension tournant à grande vitesse.

L'agitation peut être réalisée par différents moyens:
  • Elle peut être entretenue par des barreaux magnétiques siliconés appelés "SPINNER"
  • Il existe également des appareils d'agitation perfectionnés appelés des cytoculteurs qui permettent de maintenir une densité cellulaire,un environnement gazeux constant ainsi qu'un apport continu de milieux  frais et la récupération de milieux usés.
Contrôles fonctionnels des cellules en culture:
Deux caractéristiques sont à considérer:
  • La prolifération des cellules.
  • La préservation des fonctions spécialisées.
Selon que l'on débute une culture ou qu'on est en culture de routine, les paramétres de contrôle différent.

Les contrôles réalisés lors de la mise en route d'une culture:

On vérifie les conditions s'aseptie lors de la dissection et augmente la dose d'antibiotique et fongique si nécessaire.
On vérifie l'état des cellules recueillies par le bleu de trypan.


Le bleu de  trypan est un colorant qui a tendance à entrer dans les cellules qu'il rencontre. Une fois dans la cellule, la molécule en question entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et restera bleue. Cependant, cette molécule étant toxique, elle finit par tuer les cellules qui deviennent alors toutes bleues.

On vérifie la morphologie des cellules au microscope et la présence d'un marqueur biochimique spécifique du type cellulaire.

Les contrôles de routine:


Vérifier la morphologie des cellules au microscope ainsi que l'adhérence de celles-ci. Le manque d'adhérence peut dévoiler l'absence de place pour la croissance des cellules, l'inadéquation du support, un milieu "usé".  Le remplacement du milieu s'effectue tous les 2 à 3 jours. Le milieu doit être neutre ( pH 7,2 à 7,4). Inférieur à 6,5 la viabilité des cellules est menacée. Il est donc important d'utiliser un indicateur pour vérifier l'acidité du milieu comme le rouge de phénol dont le pH à l'équivalence se situe dans sa zone de virage (entre 6,6 et 8,4). En dessous de 6,6 le rouge de phénol vire au jaune.

Les techniques d'entretien:

En ce qui concerne les cellules adhérentes, le changement du milieu usé s'effectue par aspiration.
Les cellules en suspension sont tant qu'à eux, soumis à une centrifugation à 800 jets.
Lorsque la population cellulaire est confluente, on rince le milieu avec une solution EBSS (solutions salines équilibrées de earle) et on utilise de la trypsine afin de détacher les cellules cultivées sur boîte de Pétri pour ensuite les repartir sur d'autre flacon.


La conservation des cellules est indispensable pour les cellules à durée de vie limitée et pour les cellules difficiles à entretenir. Elle se fait par cryoconservation.
La conservation de longue durée se réalise dans de l'azote liquide à -180°C. Les cellules sont placées en présence de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), de FCS à 10% et de DMSO (diméthyle sulfoxide)à 10% ou de glycérol (Le DMSO et le glycérol sont des agents cryoprotecteurs) dans des tubes de congélation de 1ml. La concentration des cellules doit être de 10 milliards de cellules par ml.
La conservation de court durée se réalise à -20°C.
La décongélation des cellules se fait de manière rapide, en plaçant celles-ci sous une ampoule dégageant une température de 37°C.


L'évolution des cellules en culture:

Les cellules in-vitro présentent 2 propriétés fondamentales qui sont: la capacité proliférative et leur fonction différentiée.
Ces propriétés ont tendance à évoluer de manière très différentes quelle que soit la méthode de culture employée. Les cellules conservent la plupart du temps leur potentiel de division, pouvant être stimulé au début de la culture par des facteurs de croissances. Même si au cours du temps, on peut noter un ralentissement de celui-ci. A l'inverse, les cellules en culture voient souvent leur fonction différentiée se modifier et même disparaître. Ce phénomène de dédifférentiation peut être visible morphologiquement.
Notons que certains types cellulaires révèlent leur fonction spécifique que lorsqu'ils sont cultivés en vie ralentie. Pour cela, on procéde à un appauvrissement progressif du milieu ou on utilise une substance inhibitrice de la division cellulaire.

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Imène 28/10/2016 18:23

Thank you that helps alot

OmniTech Support Scam 03/11/2014 11:26

It was a detailed session about tissue culture and about the process of tissue culturing. I am doing my biochemistry researches and this information is very helpful for me to complete the thesis I am doing now. Thank you.

Fio 01/11/2014 21:31

Merci beaucoup vous m'avez bien aidé :)