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biotechnologie

Les hématimètres

18 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:

  • Louis-charles Malassez, scientifique français né à Nevers 1842-1909. Malassez est connu pour l'invention de l'hémocytomètre, un outil pour mesurer quantitativement le nombre de cellules sanguines.
  • Jean Nageotte, Né à Dijon 1866-1948. Il fut médecin de la Salpêtrière et professeur au collège de France. En 1902, il fait des essais de numération du liquide céphalo-rachidien et envisage la nécessité d'employer un hématimètre pouvant contenir 100 mm3 au moins de liquide.
  • George Hayem et A Nachet en 1875 élaborent un hématimètre à platine mobile transversalement pour déplacer réguliérement la cellule et faciliter la numération des globules blancs. http://gallica.bnf.fr/ark:/12148/bpt6k6274641v/f19.image​
hématimètre de Hayem  et Nachet

hématimètre de Hayem et Nachet

Définition:

 

Les numérations globulaires de différents liquides biologiques (sang, urine, liquide céphalo rachidien) sont possibles, en dehors de tout automate, grâce à l'utilisation de "cellules" de verres calibrées appelées hématimètres. Ces lames de verre épaisses creusées de rigoles, présentent un quadrillage particulier sur la plate-forme centrale légèrement abaissée. Recouverte d’une lamelle posée sur les platesformes latérales élevées, un volume très précis et connu permet de dénombrer les cellules des liquides biologiques.

  • Les prélévements de sang sont étudiés en utilisant les cellules de Malassez, Thoma ou Neubauer.
  • Les urines, on utilisera plutôt une cellule de Lemaur.
  • Les liquides céphalorachidiens, on comptabilisera en utilisant les cellules de Nageotte.

NB: Les prélévements riches en cellules doivent être comptés après dilution.

 

 

Protocole:

 

  • Passer la culture au vortex pour dissocier les amas cellulaires.
  • Repérer à l'oeil nu le quadrillage sur le centre de la lame.
  • Recouvrir avec lamelle en humectant les plates-formes latérales de l'hématimètre. Pour faire adhérer la lamelle appuyer légérement.
  • Remplir le quadrillage par capilarité, en déposant la culture à l'aide d'une pipette pasteur ou d'une micropipette. Appliquer l'extrémité de la pipette légèrement inclinée sur la plateforme centrale prés de la lamelle. Le liquide s'étend par capilarité. Le remplissage doit être rapide et réalisé en une seule fois, sans débordement dans les rigoles et sans bulles d'air.
  • Laisser les cellules sédimenter une à deux minutes avant observation.
  • Observer au microscope, objectif 10 ou 20 pour une vue d'ensemble. Vérifier la répartition homogène (si elle est hétérogène, recommencer la mise en cellule).
  • Selon l'hématimètre utilisé et selon les élèments comptés, on sera amené à compter un carré, une bande voire la cellule entière.

NB:Quel que soit l'hématimètre et la surface à compter, on compte tous les éléments situés à l'intérieur des lignes délimitant cette surface. Pour les éléments situés sur les lignes, on applique la régle de la limite des lignes, c'est à dire que les éléments qui sont présents sur le bord supérieur et sur le bord gauche sont comptabilisées mais pas ceux situés sur le bord inférieur et sur le bord droit afin d'éviter de les compter 2 fois.

 

 

Il est possible de différencier les cellules vivantes, des cellules mortes par l'utilisation de colorant.

Définition:

Un colorant est une substance qui met en évidence une structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de celle-ci.

Condition d'utilisation:

  • Le colorant doit être utilisé à concentration faible.
  • Il faut que ce colorant s'accumule dans un élèment cellulaire.

 

Il existe 2 types de colorants:

  • Les colorants vitaux ou d'inclusion. Ces colorants colorent les cellules vivantes. Exemple: le rouge neutre (colorant cationique) qui se concentre dans les vacuoles des cellules végétales et les lysosomes.
  • Les colorants supravitaux ou d'exclusion. Ces colorants colorent les cellules mortes. Ils ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un mécanisme d'exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme necessite de l'énergie sous forme d'ATP que seules les cellules vivantes possédent.  Exemples: Le bleu Trypan, l'érythrosine B, le bleu de méthylène de Funk (Il sera réduit sous forme incolore dans les cellules en activité), les colorants fluorescents ( l'iodure de propodium; le bromure d'éthydium).

Calcul des résultats:

 

Nous prendrons comme exemple l'utilisation de la cellule de Malassez.

la dimension d'une bande est de :

  • longueur 2,5 mm
  • largeur 2 mm
  • hauteur 0,20 mm

​Soit un volume du quadrillage total de 1 μL

Cette bande est constituée de 100 rectangles d'égales surfaces dont 25 sont dévisés en 20 petits carrés pour faciliter le comptage.

Un rectangle ou unité de comptage contient 0,01 mm3 c'est à dire 0,01μL

rappel: 1 mm3 = 1 μL = 1.10-3 mL = 1. 10-6 L

Formule à appliquer:

N= n/a.v x Fd

N: nombre de cellules par unité de volume

n: nombre de cellules comptées

Fd: facteur de dilution

a: nombre d'unités de comptage dénombrées

v: volume d'une unité de comptage

 

les différents types d'hématimètres différent par le volume de l'unité de comptage ou par le nombre total d'unité de comptage. On utilisera la même formule en adaptant ces différences dans le calcul.

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Les hématimètres

La cellule de Nageotte

Le quadrillage total est constitué de 40 bandes (chaque bande a un volume de 1,25 μL).

La dimension d'une bande est de :

  • longueur 10 mm
  • largeur 0,25 mm
  • hauteur 0,5 mm

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La cellule de Thoma

NB: La cellule de Thoma est déconseillée pour la numération des leucocytes du fait de sa faible profondeur.

Le quadrillage total:

  • Un grand carré de coté 1mm
  • Hauteur 0,1 mm​

Soit un volume du quadrillage total de 0,1 μ

La cellule de Thoma est constituée de 16 grands carrés contenant 16 petits carrés,  de 4 groupes de 3 lignes horizontale et de 4 groupes de 3 lignes verticales.

Les cotés de chaque petit carré mesurent 0,05 mm.

Le volume délimité par un petit carré est de 0,00025 μL soit pour 16 petits carrés un volume de 0,004 μL.

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Les hématimètres

La cellule de Neubauer

Les leucocytes sont comptés dans les quatre grands carrés bleus composés de 16 petits carrés (= 64).

Les érythrocytes et les thrombocytes sont comptés dans les 4 lignes rouges dans le quadrillage central

composé de 20 très petits carrés (= 80).

La hauteur entre la chambre et la lamelle est de 0,1mm.

 

Le volume est de :

- grand carré 1mm x 1mm x 0,1 mm = 0,1 mm= 0,1 μL

- très petit carré 0,05mm x 0,05mm x 0,1 mm = 0,00025 mm= 0,00025 μL

Les hématimètres

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