Vendredi 6 février 2009 5 06 /02 /Fév /2009 10:27

Historique:

 

 On trouve la première réfèrence d'un processus chromatographique dans l'Ancien Testament qui fait mention de propriétés adsorptives de certaines variétés de bois pour adoucir de l'eau amère. Ce sont les tanins hydrophobes qui constituaient une phase stationnaire apolaire (Chromatographie d'adsorption).


Aristote décrit les propriétés que possèdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Les phénomènes mis en jeu révèlent ici de l'échange d'ions.


En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT inventa la chromatographie par adsorption. Il procéda de la manière suivante: 

Il verse dans une colonne de verre remplie de carbonate de calcium finement pulvérisé un extrait de feuilles vertes à l'éther de pétrole, puis il ajoute une certaine quantité du même solvant pur. Il constate ainsi, que le pigment végétal, d'abord retenu au sommet du récipient, se divise en plusieurs zones en descendant le long de la colonne, à des vitesses différentes, à mesure que le solvant s'écoule au travers du carbonate de calcium, produit adsorbant retenant les substances à sa surface. Ainsi apparaissent successivement une zone jaune pâle d'allure lente, deux zones vertes et trois jaune. Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de chromatographie (du grec Khrôma, couleur et graphein, écrire) définit comme l'enregistrement graphique des couleurs.

  

 



En  1941, Archer John Porter MARTIN et Richard Laurence Millington SYNGE publient la théorie de la chromatographie de partage sur gel de silice
 En 1938, afin d'étudier les acides aminés constituant la laine, ils réalisent des travaux sur la distribution des acétyl-amino-acides entre l'eau et le chloroforme. Ils imaginent ainsi un dispositif d'extraction fractionnée.
  La phase aqueuse est fixée à demeure sur une colonne de gel de silice qui peut retenir de 50 à 100% de son poids d'eau.  Sur cette colonne, il fait traverser une solution des composés à séparer, en l'occurrence des dérivés acétylés d'acides aminés mélangés avec du chloroforme et du butanol.Il réalisent ensuite des extractions successives.


1944 CONSDEN, GORDON et MARTIN inventent la chromatographie de partage sur papier (le papier servant de support de la phase stationnaire) . Le principe  consiste à plonger l'extrémité d'une bande de papier filtre dans un solvant organique saturé d'eau. On dépose à cette extrémité une goutte de la solution à analyser : par capillarité, la phase mobile avance sur le papier. Au fur et à mesure que le solvant progresse, les constituants du soluté se répartissent suivant leur coefficient de partage entre le solvant et l'eau retenue par la cellulose du papier.


1948 Archer John Porter Martin avec la collaboration du Dr A. T. James met au point la chromatographie en phase gazeuse pour séparer des mélanges d'acides et d'amines.


Principe:

 

La chromatographie est une technique analytique qui permet la séparation des constituants d'un mélange en phase homogène liquide ou gazeuse.
Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases en contact : la phase stationnaire (emprisonnée dans la colonne) et la phase mobile (l'éluant) qui se déplace.
La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants présents dans la colonne.
Ces derniers la parcourent avec des temps proportionnels à leurs propriétés intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, ...). A leur arrivée en bout de colonne, le détecteur mesure en continu la quantité de chacun des constituants du mélange.


Le type de support utilisé pour la séparation des constituants d'un échantillon permet de distinguer plusieurs types de chromatographie:

La chromatographie d'absorption (interraction chimique)
La chromatographie de partage (solubilité dans l'une des 2 phases)
La chromatographie d'affinité (reconnaissance par forme)
La chromatographie d'échange ionique (force ionique)
La chromatographie de filtration (exclusion par taille)

La chromatographie d'adsorption:


On la définie également comme une chromatographie solide-liquide car elle est basée sur une séparation des solutés au moyen de 2 forces opposées:

La rétention par adsorption sur la phase stationnaire.

L'entrainement par le courant de l'éluant sur la phase mobile.

L'adsorption est un phénomène de surface lié à la polarité des molécules.
Lors du passage du soluté, des interractions polaires s'effectuent entre celui-ci et la silice  tandis que l'éther de pétrole (apolaire) passe sans éluer la molécule du soluté.


Exemple d'application:


La technologie CCM ou chromatographie sur couche mince.

     

       Avantage:


Simple et rapide à mettre en oeuvre

Coût faible

Analyse qualitative uniquement

     

       Principe:


On utilise pour la phase mobile un solvant ou un mélange de solvants et pour la phase stationnaire un adsorbant (comme une couche d'environ 0,25mm de géle de silice, l'alumine, le kieselguhr ou la cellulose) avec un liant (comme le sulfate de calcium hydraté, l'amidon ou un polymère organique) permettant ainsi la fixation de celui-ci sur une plaque de verre, d'aluminium ou de plastique. L'échantillon (environ un microlitre de solution diluée (2 à 5%) du mélange à analyser) est déposé ponctuellement sur la plaque. Les constituants de l'échantillon sont élués par la phase mobile qui grimpe par capillarité vers le haut de la plaque. Ils peuvent être identifiés par comparaison avec l'élution simultanée de témoins.


       Protocole expérimental:


La préparation de l'échantillon se fait par l'intermédiaire de solvants volatils qui peut être différent de l'éluant. Les solvants les plus utilisés sont le chloroforme, la propanone et le dichlorométhane.


Le dépot de l'échantillon se fait en un point de la plaque situé à environ 1cm de la partie inférieure à l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en appuyant légèrement et briévement l'extrémité de la pipette sur la couche adsorbant. Le dépot ne doit pas dépasser 3mm de diamétre.


Préparation de la cuve et mise en place de la plaque dans le cas de la chromatographie ascendante:

on verse l'éluant  à environ 0,5 cm du fond de la cuve.  la plaque est  ensuite placée en position verticale dans la  cuve et l'éluant qui en recouvre le fond monte par capillarité. on place un papier absorbant et on ferme la cuve de manière à former un environnement saturant de vapeur  afin d'éviter l'évaporation de l'éluant lors de son ascension le long de la plaque.


La migration: pendant  la migration, la cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée. Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1cm de l'extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée à l'air libre ou à l'aide d'un séchoir.


NB: Attention dans le choix de l'éluant:


Un éluant trop polaire entraine tous les constituants de l'échantillon. Aucune séparation n'est effectuée.

Un éluant trop apolaire n'entraine pas assez les constituants de l'échantillon. les spots obtenus risquent d'être un mélange de constituants de l'échantillon.


La révélation:

Si les composants de l'échantillon sont colorés, il facile de les repèrer sur la plaque.

Si les composants de l'échantillon sont invisibles, on les rend visibles par des méthodes usuelles de révélation comme la radiation UV, la fluorescence, l'iode ou l'atomisation.


La méthode par la radiation  UV est une méthode de révélation non destructive. Les composants de l'échantillon apparaissent sous forme de taches brillantes. On peut également incorporer un indicateur fluorescent à l'adsorbant. Lors de la révélation au radiation UV,  la plaque entière devient fluorescente tandis que les composants de l'échantillon apparaissent sous forme de taches sombre.


La méthode par exposition de la plaque aux vapeurs d'iode est une méthode non destructive. La plaque est placée dans un atmosphère saturé en vapeur d'Iode. Les composants apparaissent sous forme de taches brunes par fixation réversible de l'Iode. La coloration est labile et disparaît après élimination des vapeurs d'Iode.

 




Chromatographie sur couche mince
envoyé par soschimie
La chromatographie de partage:

On la définie également comme une chromatographie liquide-liquide  ou liquide gazeux.
Cette chromatographie est fondée sur la répartition différentielle de chacun des solutés entre deux liquides non miscibles, l'un constituant la phase stationnaire, l'autre la phase mobile. On joue sur la notion se solubilité.

C'est une technique qualitative.

Principe de partage:

Lorsque l'on ajoute un composé dans un milieu comprenant deux phase liquides non miscibles en contact, celui-ci va se répartir dans ces deux phases dans des proportions bien définies dépendantes de son coefficient de partage K entre ces deux phases. Ce coefficient est une constante thermodynamique d’équilibre définie à une température T et à un pH donné, relative à l'équilibre suivant :








on a alors :

K=K°(T)= [concentration dans la phase 2] / [ concentration dans la phase 1]

La chromatographie de partage peut se réaliser selon 2 types de polarité de phase:

La polarité de phase normale
La polarité de phase inverse

Dans le cas de la polarité de phase normale, la phase stationnaire  est hydrophile et la phase mobile (l'éluant) est hydrophobe.
Dans le cas de la polarité de phase inverse, la phase stationnaire est hydrophobe et la phase mobile (l'éluant) est hydrophyle.

NB:
La phase stationnaire peut être constituée par un film liquide imprégné sur un support rigide ou fixé (gel de silice) par liaison covalente (phases greffées).  Le greffage est réalisé par silanisation créant ainsi des ponts siloxane (Si-O-Si) .

Exemple d'application:

La chromatographie sur papier unidimensionnelle en polarité de phase normale

Principe:

La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau .La phase stationnaire est constituée par l'eau elle même, absorbée par la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en chromatographie sur couche mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé en un point repère du papier et le solvant qui se déplace par capillarité fait migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables selon leur solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.
 

utilisation:
La chromatographie sur papier est employée principalement pour l'analyse de composés très polaires, tels que les acides aminés, les sucres et les composés polyfonctionnels.

 Inconvénients:
Ses plus grands inconvénients par rapport à la chromatographie sur couche mince sont :

               - une durée de développement beaucoup plus longue

               - une séparation généralement moins bonne.


Ps: l'utilisation de papiers spécifiques est fortement recommandé car ceux-ci possédent un faible taux d'impuretés et  des caractéristiques physiques unifor
mes.
exemples : papier Whatman;Schleider; Shüll; Durieux; Arches.


Par Magniez frédérick - Publié dans : biotechnologies
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Mercredi 2 juillet 2008 3 02 /07 /Juil /2008 14:27

Histoire:

L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892.  Ils se sont inspirés des études de  Hermann Von Helmholtz menées sur l'électro-osmose. Celui-ci constate qu'il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe  opposé à leur charge.

En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'électrophorèse libre. Cette technique
lui a permis de séparer les protéines du serum sanguin en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée afin de réaliser des mesures optiques au travers du tube.
Il a pu ainsi obtenir sur le pôle + des protéines de charge très négative comme l'abumine et sur le pôle - des protéines de charge plus positive comme les globulines.
Cette technique ne permet  toutefois pas de séparer totalement les protéines. Il est néanmoins possible de mettre en évidence les frontières formées par des méthodes optiques comme la fluorescence, l'absorption des UV ou l'indice de réfraction.

En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant la technique d'électrophorèse sur papier.

En 1952,
Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode connue sous le nom d'analyse immuno-électrophorétique, qui permet d'analyser de manière précise des mélanges très complexes d'antigènes. Dès la première application de cette méthode à l'analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30 constituants indépendants, alors que l'électrophorèse en veine liquide ou sur papier ne permettait d'isoler que 5 ou 6 groupes de protéines. La méthode est rapidement utilisée dans de nombreux laboratoires médicaux pour des besoins de diagnostiques.

En 1955,  O. Smithies met au point la technique d'électrophorèse en gel d'amidon.

En 1957, Joachim Kohn sépare les différents phénotypes de l'hémoglobines en élaborant la technique d'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose.

En 1969, Beber et Osborn
introduisent l'agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les différentes sous-unités protéiques.

Principe:

L'électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique)  sous l'effet d'un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode respective: les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (potentiel positif)  et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (potentiel négatif). En ce qui concerne les molécules non chargées,  il n'existe pas de migration. Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l'électrophorèse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la matrice par ces ions différent. Cela permet ainsi de les séparer.

Avantages:

L'électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps.
La séparation est fine.

On peut déterminer 2 types d'électrophorèses:

L'électrophorèse dite "libre" en veine liquide (mise au point par Tisélius en 1937).
L'électrophorèse de zone sur support.

L'électrophorèse en veine liquide.

La migration dans ce type d'électrophorèse s'effectue au sein d'un liquide de composition déterminée soumis à un champ électrique de courant continu (cf. Histoire).

Avantage:

Permet une bonne détermination des mobilités électrophorétiques.

Inconvénients:

Appareillage couteux
.
La mise en oeuvre et longue et délicate.

Les particules ne se séparent pas complètement mais il se forme des frontières mise en évidence par des méthodes optiques telles que l'absoption ultra-violette pour les protéines.

L'électrophorèse de zone.

Ce type d'électrophorèse utilise un support poreux pour stabiliser la phase liquide.  Le support doit être homogène, poreux et inerte. Différents types de support peuvent être utilisés:
Support en papier ou acétate (la migration des mélanges s'effectue à la surface de celui-ci).
Support en polyacrylamide ou agarose (la migration des mélanges s'effectue à l'intérieur même du support).

Avantages:

 
Les fractions séparées migrent comme des "zones" individuelles.

La taille des mailles ("pores")  pour les supports en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentir le déplacement des grosses molécules)
.

2 types de montage peuvent être mis en place:

Montage horizontal:

Utilisé pour les supports en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme de longue et
étroite bande.
Les extrémités du support plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa surface.

Montage vertical:

Utilisé pour les supports en gel polyacrylamide ou, plus rarement d'agarose . Le gel est souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Durant la gélification on aura pris soin de faire des puits où on déposera les échantillons. Chaque extrémité du gel est mis en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui permettra la propagation d'un courant dans le gel.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):

Cette technique est très utilisée en immunologie et dans l'étude des protéines car elle permet, après la séparation des différentes protéines, leur transfert sur une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène afin d'être identifier par le biais d'anticorps spécifiques.

Cette technique est également utilisée pour le séquençage de l'ADN (les méthodes traditionnelles de Maxam et Gilbert ou de Sanger permettent de séquencer  à la  paire de bases près).

La matrice de cette électrophorèse:
Le gel  de polyacrylamide est constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant. En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient différents maillages et donc différentes densités de gel.
La polymérisation est réalisée grace à l'ajout de 2 réactifs: le TEMED (N,N,N',N' tetra-méthyl-èthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent des anions hyperactifs en présence de lumière.

La densité typique d'un gel de séparation peut être à 6%; 8%; 10%; 12% ou 15%.
Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des protéines.
Des niveaux de densité plus faibles du gel permettent de séparer des protéines de poids moléculaires proches.

La densité d'un gel de concentration  (stacking gel) est à 5%. Ce gel est coulé en haut du gel de séparation. Il permet à l'échantillon une entrée homogène dans le gel de séparation. On utilise un "peigne" afin de créer des "puits" individuels pouvant accueillir chaque échantillon.

Le SDS-PAGE:
Une variante de cette technique consiste à utiliser du SDS (Sodium Dodécylsulfate) qui est un détergent anionique fort.  Il a la propriété de défaire la structure spatiale en se fixant sur les protéines et de les charger de la même façon permettant ainsi de les séparer uniquement en fonction de leur masse moléculaire.
Les protéines sont dites dénaturées: elles ont perdu leur structure tridimentionnelle native.

 Avant de procéder à la dénaturation des protéines avec du SDS, on utilise un agent réducteur, le b mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des proteines  les rendant ainsi sous forme monomérique.
****
Protocole expérimental:

préparation des échantillons:

Les échantillons vont être traités dans
du tampon de dénaturation . Celui-ci sera préparé au dernier moment.

tampon de dénaturation se compose:
de tampon Tris Hcl 0,125 mL pH 6,8
d'eau distillée;
de SDS à 4%
de b mercaptoéthanol à 10%;
de bleu de bromophénol à 0,2%
de glycérol pur

50 microlitres d'échantillons sont mélangés avec 50 microlitres de tampon dénaturant.
L'ensemble est ensuite chauffé pendant 4 minutes afin de favoriser la dénaturation des protéines.

Le matériel d'électrophorèse se compose:
des plaques
des pinces
le joint d'étanchéité
Le peigne
les espaceurs

On nettoie les plaques avant utilisation à l'aide d'eau (éventuellement savonneuse) puis avec de l'alcool à 70%. On essuie les plaques avec un papier, sans laisser les fibres sur les faces où sera coulé le gel.
On pose le joint d'étanchéité sur la plaque à bords rond.
Puis, mise en place des espaceurs et de la deuxième plaque en verre. L'ensemble est ensuite consolidé à l'aide des pinces.

Préparation de 30 ml de gel de séparation:
7,50 mL d'acrylamide bis acrylamide
11,25 mL de tampon Tris/Hcl  pH8,8
0,30 mL de SDS à 10%
10,95 mL
d'eau

pour la polymérisation on ajoute
30 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
300 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%

La préparation est aussitôt coulée entre les 2 plaques à l'aide d'une pipette. Afin d'éviter la présence de bulle dans le gel, on incline le montage lors du remplissage. Le gel est ensuite recouvert d'eau distillée afin d'obtenir une surface parfaitement horizontale.

Préparation de 10 ml de gel de concentration:

1,25 mL d'acrylamide bis acrylamide
1,25 mL
de tampon Tris/Hcl  pH6,8
0,10 mL
de SDS à 10%
7,4 mL
d'eau

pour la polymérisation on ajoute
 40 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
 100 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%

Retirer l'eau distillée au dessus du gel de séparation puis remplir le montage comme précèdemment jusqu'au niveau supérieur des plaques de verre.  Le peigne est alors mis en place pour former des puits dans le gel de concentration.

Préparation d'un litre de tampon de migration:

12,5 mL de Tris 25mM
14,4 g de glycine
977,5 mL d'eau distillée
10 mL SDS 10%

Le peigne est retiré puis les plaques et les cuves de migration sont placées sur le support . Les cuves sont remplies avec le tampon de migration en commençant par la partie supérieure puis inférieure.  Dépot de 50 microlitres d'échantillon protéique dénaturé dans chaque puit à l'aide d'une seringue et selon la technique sous-marine.
Les électrodes de la cuve sont reliées au générateur. La migration se fait à 30 mA jusqu'à ce que le bleu de bromophénol atteigne le bord inférieur des plaques.

Révélation:
Le gel est retiré des plaques puis placé sur un agitateur et coloré pendant 30 minutes dans une solution de coloration composée de bleu de coomassie à 2,5%,d'isopropanol à 20%, d'acide acétique à 20% et d'eau à 57,5% puis décoloré pendant 3 fois 30 minutes avec une solution décolorante composée de 45% d'isopropanol, de 10% d'acide acétique et de 45% d'eau.



Par Magniez frédérick - Publié dans : biotechnologies
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Mardi 8 avril 2008 2 08 /04 /Avr /2008 11:27
Histoire:

La technique d'ELISA a été conceptualisée et développée par 2 scientifiques suédois, Peter Perlmann (investigateur principal) et Eva Engvall à l'Université de Stockholm en 1971.

A la fin des années 60, Stratis Avrameas et GB Pierce mettent au point la technique d'immunoenzymologie, technique d'analyse par réaction entre antigènes et anticorps et utilisant comme marqueur des enzymes.

Principe:

La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet  de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.

Avantages de la technique:

  • L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.
  • Possibilité de quantifier grâce à la réalisation d'une gamme en parallèle.
  • L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible.
  • technique accessible à tous les biologistes.
  • La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage spécialisé.
  • La validité des trousses est d'environ 1 an.
Inconvénients de la technique:
  • La limite de détection est moins bonne que la technique RIA.
  • La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température, du pH et de l'éclairement.
Le test ELISA indirect:

Ce test permet de détecter ou doser des anticorps.
il se réalise en 4 étapes:

La première étape appelée "coating" de l'antigène:
Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les plaques sont incubées à 4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage.

La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de lavage.


La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de détection:
On incube à 37°C dans  les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent  spécifiquement sur les anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grace à l'apparition d'une coloration.

La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:
On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la présence de l'anticorps à doser. L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps recherché.

Exemple d'application:

Identification dans le sérum du patient, les anticorps anti-protéines de l'enveloppe et du corps du virus de l'immunodéficience humaine.
 


Le DAS ELISA direct ou Double Antibody Sandwich ELISA direct:
Dans ce cas de figure, l'antigène se trouve entre 2 anticorps spécifiques. L'utilisation de la DAS ELISA nécessite de posséder 2 anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents sur l'antigène.

La première étape consiste à fixer sur le support, l'anticorps de capture. On incube la solution à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.

Lors de la deuxième étape, on dépose l'échantillon possédant l'antigène à identifier qu'on laisse incuber à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.

Dans une troisième étape, on fixe l'anticorps de détection marqué avec une enzyme sur l'antigène recherché. Pour cela, on dépose la solution d'anticorps dans les puits puis on incube l'ensemble à 37°C pendant 2 heures.

La dernière étape, on  dépose
une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme et on laisse incuber pendant 30 à 120 minutes. Le produit de réaction obtenu est soluble et coloré. L'intensité de cette coloration peut être mesurée à l'aide d'un photomètre.
NB: la différence entre le DAS ELISA direct et le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine réside au niveau de l'anticorps de détection. Pour le DAS ELISA indirect
par le système biotine-streptavidine
, l'anticorps de détection porte une molécule de biotine qui interragie avec la streptavidine couplé à une enzyme.


La sensibilité du test DAS-ELISA direct se situe entre 1 et 10 ng/ml. Cette sensibilité peut être augmentée par l'utilisation du système indirect du fait de la forte affinité entre la streptavidine et la biotine.
Par Magniez frédérick - Publié dans : biotechnologies
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Mardi 11 mars 2008 2 11 /03 /Mars /2008 11:15

Définition:

Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont  identiques car produits par un clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes). Les anticorps monoclonaux sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic et dans des buts thérapeutiques.

La production de ces anticorps  in-vitro est très difficile à cause de la faible durée de vie des plasmocytes.

In-vivo, la production de ces anticorps peut être obtenue en injectant chez l'animal un antigène donné puis extraction de ceux-ci dans le sang. Cette méthode est très couteuse et très peu d'anticorps sont obtenus.

L'élaboration de la technique des hybridomes par César Milstein et Georges köhler en 1975 a permis d'obtenir une grande quantité d'anticorps à faible coût et ainsi permettre de les utiliser  dans de nombreuses applications.
Cette technique consiste à injecter l'antigène d'intérêt chez une souris puis de prélèver, au bout de quelques semaines, les cellules de la rate. Parmis ces cellules se trouvent des plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi. On fusionne ces plasmocytes avec des cellules de tumeur appelées cellules myélomateuses (cellules immortelles) grâce à l'addition de polyéthylène glycol (PEG) qui induit la fusion membranaire et permet ainsi d'obtenir des hybridomes qui ont la capacité de se multiplier plus rapidement que les cellules normales du corps productrices d'anticorps et de développer indéfiniment des anticorps spécifiques. Les cellules sont ensuite réparties dans des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits. Afin d'éliminer les plasmocytes et les cellules myélomateuses non fusionnées, on utilisera un milieu de culture sélectif (milieu de culture HAT). Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et les cellules myélomateuses utilisées ayant un gène non fonctionnel pour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides-hypoxanthine - guanine - phosphoribosyl - transférase (HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT (hypoxanthine aminoptérine thymidine).
Seules les cellules hybrides se multiplient. Au bout d'une dizaine de jours, on recherche dans chaque puits la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène utilisé pour immuniser la souris. On repique les cellules productrices. On isole ainsi quelques clones cellulaires producteurs qui pourront être conservées dans l'azote liquide.
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Exemples d'application:


  • Test d'ovulation: les anticorps monoclonaux anti-hormone lutéinisante qui révèlent l'augmentation du taux d'hormone LH (signe précurseur de l'ovulation).

  • Test de grossesse: le principe repose sur la détection de l'hormone hGC (human Chorionic Gonadotropin) dans les urines par le biais d'une réaction colorée spécifique grâce à l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-hGC.

  • Fabrication des anticorps monoclonaux contre des antigènes portés par des cellules tumorales afin de les détruire. L'intérêt de l'utilisation des anticorps monoclonaux pour un traitement anti-cancereux réside dans la spécificité de ceux-ci à détruire des cellules cibles. On peut soit utiliser des anticorps seuls (anticorps nus) qui en s'attachant à la cellule entraînent sa mort ou associés à une autre molécule comme une toxine ou un produit radioactif. L'anticorps sert dans ce cas là, à amener vers la cellule tumorale l'élèment qui va la détruire.

  • Test ELISA: utilisation des anticorps monoclonaux comme anticorps traceurs dans le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Ce type de test est utilisé notamment dans le dépistage de la séropositivité au virus VIH, c'est à dire pour mettre en évidence la présence d'anticorps anti-VIH dans le sérum.
Inconvénient :
Comme la plupart des anticorps monoclonaux sont produits dans des cellules de rongeurs, on peut observer une réaction immunitaire lors de leur injection chez un patient. Cette imunité inactive progressivement l'action bénéfique de l'anticorps monoclonal. Pour remédier à ce problème, on produit des anticorps "chimériques" ou "humanisés".

Les anticorps "chimériques" sont obtenus par greffage des parties constantes d'immunoglobuline humaine sur les parties variables d'un anticorps de souris.
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les anticorps “humanisés” sont produits par fermentation microbienne ou par des souris transgéniques contenant seulement une partie des gènes humains à l'origine des Anticorps. Ils sont potentiellement mieux tolérés dans l'organisme humain.
Par Magniez frédérick - Publié dans : biotechnologies
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Lundi 25 février 2008 1 25 /02 /Fév /2008 10:00
Présentation de la PCR:

cette technique fut imaginée par le scientifique américain Karry Bank Mullis et développée par le Dr H.A. Herlich avec la collaboration de la compagnie Cetus en 1985.

La PCR ou Polymérase Chain Reaction conduit à l'amplification in-vitro de plusieurs millions de fois une séquence spécifique d'acide nucléique qui peut être minoritaire voir très rare (10-2pg). Elle exploite le processus de la réplication et fait appel, pour cela, sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d'un ADN servant de matrice. Pour initier le processus, des amorces (ou primer) s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN polymérase de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de nouveaux ADN doubles brins.

La PCR s'effectue sur 3 étapes:

  • La dénaturation thermique de l'ADN: à 95°C, les liaisons d'hydrogènes sont rompues et les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme simple brin dans le milieu.
  • Hybridation des amorces: le milieu réactionnel contient 2 amorces, chacune complémentaire d'un des 2 brins. La température permettant la fixation des amorces sur les monobrins d'ADN est comprise entre 50°C et 65°C. Les amorces en larges excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires.
  • Extention des amorces: intervention de la taq polymérase (ADN polymérase) qui allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléiques complémentaires de la séquence de la matrice auquel elle est hybridée. Cette étape s'effectue à une température de 72°C.
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  • Au deuxième cycle: la quantité d'ADN continue de doubler et les premiers brins dont la taille est limitée par les 2 amorces font leur apparition.
  • Au troisième cycle: Les premiers amplicons apparaissent (ADN double brins borné par les amorces correspondant au fragment d'ADN recherché).

En théorie, après n cycles, on augmente le nombre d'ADN interressant  de 2n.
En pratique, le nombre de brins est limité à cause de la baisse de certains réactifs, l'augmentation de la viscosité du milieu et la baisse de l'activité de l'ADN polymérase thermostable.
A l'issue de la PCR, on obtient des fragments de même taille correspondant à la distance en base qui sépare les amorces
.

La technique PCR se réalise par le biais d'un appareil programmable appelé un thermocycleur dans lequel sont placés les microtubes contenant le mélange réactionnel. Cet appareil permet d'exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l'expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide, elle ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).

Composition du mélange réactionnel dans les microtubes:

Le mélange s'effectuera toujours sur la glace et les différents élèments qui le compose seront placés dans l'ordre suivant dans les microtubes:
H20, le tampon, MgCl2, les nucléotides, les amorces, l'enzyme ( taq polymérase) et enfin l'ADN à amplifier.
NB: on réalise toujours un témoin dans lequel l'ADN est remplacé par de l'eau (témoin négatif) afin de déceler une éventuelle contamination (
la contamination par de l'ADN précédemment amplifié représente le principal risque). Un témoin positif permettra de valider la bonne conservation des réactifs, de l'enzyme responsable de la polymération et des performances du thermocycleur. un témoin interne présent dans le milieu réactionnel renseignera sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de l'amplification.

Révélation des produits d'amplification:

Lorsque la quantité de produits d'amplification est suffisante, ceux-ci sont soumis à une électrophorèse  en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt (Bromure d'éthydium: produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques faisant apparaitre à la molécule d'ADN une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 30 nm)). La vitesse de migration étant dépendant de la masse de la molécule, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons peuvent être facilement vérifiable sur le gel.

Intérêts de la technique PCR:
  • La PCR peut être un outil très avantageux dans la détection de génes mutés responsables de cancers et de maladies génétiques.
  • Elle peut également être très utile pour le suivi des thérapies anticancéreuses et ainsi permettre au médecin de poursuivre ou pas le traitement.
  • Comme certains cancers  sont induits par translocation chromosomique, la PCR identifie la présence ou pas de réarengements chromosomiques  avec une sensibilité plus importante par rapport à d'autres techniques (elle peut ainsi détecter une cellule cancéreuse pour un million de cellules normales).
  • La PCR peut servir dans la détection d'infection virale ou bactérienne. Elle est utilisée dans l'identification du virus du SIDA.
  • La PCR peut intervenir dans l'étude concernant l'évolution des espèces. La divergence des espèces à partir d'un ancêtre commun est reflétée par le degré de divergence entre les séquences nucléotidiques des génes. La mesure de cette divergence nucléotidique peut être utilisée pour déterminer le lien de parenté entre différentes espèces.
Par Magniez frédérick - Publié dans : biotechnologies
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