Mercredi 2 juillet 2008
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Histoire:
L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se sont inspirés des études de Hermann Von Helmholtz
menées sur l'électro-osmose. Celui-ci constate qu'il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe opposé à leur charge.
En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'électrophorèse libre. Cette technique lui a permis de séparer les
protéines du serum sanguin en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée afin de réaliser des mesures
optiques au travers du tube.
Il a pu ainsi obtenir sur le pôle + des protéines de charge très négative comme l'abumine et sur le pôle - des protéines de charge plus positive comme les globulines.
Cette technique ne permet toutefois pas de séparer totalement les protéines. Il est néanmoins possible de mettre en évidence les frontières formées par des méthodes optiques comme la
fluorescence, l'absorption des UV ou l'indice de réfraction.
En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant la technique d'électrophorèse sur papier.
En 1952, Pierre Grabar élabore,
en collaboration avec C.A. Williams, une méthode connue sous le nom d'analyse immuno-électrophorétique, qui permet d'analyser de manière précise des mélanges très complexes
d'antigènes. Dès la première application de cette méthode à l'analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30 constituants indépendants, alors que l'électrophorèse
en veine liquide ou sur papier ne permettait d'isoler que 5 ou 6 groupes de protéines. La méthode est rapidement utilisée dans de nombreux laboratoires médicaux pour des besoins de
diagnostiques.
En 1955, O. Smithies met au point la technique d'électrophorèse en gel d'amidon.
En 1957, Joachim Kohn sépare les différents phénotypes de l'hémoglobines en élaborant la technique d'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose.
En 1969, Beber et Osborn introduisent l'agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les différentes sous-unités protéiques.
Principe:
L'électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un champ électrique.
Ceux-ci migrent vers leur électrode respective: les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (potentiel positif) et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode
(potentiel négatif). En ce qui concerne les molécules non chargées, il n'existe pas de migration. Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l'électrophorèse, la vitesse
de migration et la distance parcourue dans la matrice par ces ions différent. Cela permet ainsi de les
séparer.
Avantages:
L'électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps.
La séparation est fine.
On peut déterminer 2 types d'électrophorèses:
L'électrophorèse dite "libre" en veine liquide (mise au point par Tisélius en 1937).
L'électrophorèse de zone sur support.
L'électrophorèse en veine liquide.
La migration dans ce type d'électrophorèse s'effectue au sein d'un liquide de composition déterminée soumis à un champ électrique de courant continu (cf.
Histoire).
Avantage:
Permet une bonne détermination des mobilités électrophorétiques.
Inconvénients:
Appareillage couteux.
La mise en oeuvre et longue et délicate.
Les particules ne se séparent pas complètement mais il se forme des frontières mise en évidence par des méthodes optiques telles que l'absoption ultra-violette pour les protéines.
L'électrophorèse de zone.
Ce type d'électrophorèse utilise un support poreux pour stabiliser la phase liquide. Le support doit être homogène, poreux et inerte. Différents types de
support peuvent être utilisés:
Support en papier ou acétate (la migration des mélanges s'effectue à la surface de celui-ci).
Support en polyacrylamide ou agarose (la migration des
mélanges s'effectue à l'intérieur même du support).
Avantages:
Les fractions séparées migrent comme des "zones" individuelles.
La taille des mailles ("pores") pour les supports en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentir le déplacement des grosses molécules).
2 types de montage peuvent être mis en place:
Montage horizontal:
Utilisé pour les supports en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme de longue et étroite bande.
Les extrémités du support plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa surface.
Montage vertical:
Utilisé pour les supports en gel polyacrylamide ou, plus rarement d'agarose . Le gel est souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Durant la gélification on aura
pris soin de faire des puits où on déposera les échantillons. Chaque extrémité du gel est mis en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui permettra la propagation d'un courant dans
le gel.
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):
Cette technique est très utilisée en immunologie et dans l'étude des protéines car elle permet, après la séparation des différentes protéines, leur transfert sur
une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène afin d'être identifier par le biais d'anticorps spécifiques.
Cette technique est également utilisée pour le séquençage de l'ADN (les méthodes traditionnelles de Maxam et Gilbert ou de Sanger permettent de séquencer à la paire de bases
près).
La matrice de cette électrophorèse:
Le gel de polyacrylamide est constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est
l'agent portant. En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient différents maillages et donc différentes densités de gel.
La polymérisation est réalisée grace à l'ajout de 2 réactifs: le TEMED (N,N,N',N' tetra-méthyl-èthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent des anions hyperactifs en
présence de lumière.
La densité typique d'un gel de séparation peut être à 6%; 8%; 10%; 12% ou 15%.
Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des protéines.
Des niveaux de densité plus faibles du gel permettent de séparer des protéines de poids moléculaires proches.
La densité d'un gel de concentration (stacking gel) est à 5%. Ce gel est coulé en haut du gel de séparation. Il permet à l'échantillon une entrée homogène dans le gel de séparation.
On utilise un "peigne" afin de créer des "puits" individuels pouvant accueillir chaque échantillon.
Le SDS-PAGE:
Une variante de cette technique consiste à utiliser du SDS (Sodium Dodécylsulfate) qui est un détergent anionique fort. Il a la propriété de défaire la structure spatiale en se
fixant sur les protéines et de les charger de la même façon permettant ainsi de les séparer uniquement en fonction de leur masse moléculaire.
Les protéines sont dites dénaturées: elles ont perdu leur structure tridimentionnelle native.
Avant de procéder à la dénaturation des protéines avec du SDS, on utilise un agent réducteur, le b mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures des proteines les rendant
ainsi sous forme monomérique.
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Protocole expérimental:
préparation des échantillons:
Les échantillons vont être traités dans du tampon de dénaturation . Celui-ci sera préparé au dernier moment.
tampon de dénaturation se compose:
de tampon Tris Hcl 0,125 mL pH 6,8
d'eau distillée;
de SDS à 4%
de b mercaptoéthanol à 10%;
de bleu de bromophénol à 0,2%
de glycérol pur
50 microlitres d'échantillons sont mélangés avec 50 microlitres de tampon dénaturant.
L'ensemble est ensuite chauffé pendant 4 minutes afin de favoriser la dénaturation des protéines.
Le matériel d'électrophorèse se compose:
des plaques
des pinces
le joint d'étanchéité
Le peigne
les espaceurs
On nettoie les plaques avant utilisation à l'aide d'eau (éventuellement savonneuse) puis avec de l'alcool à 70%. On essuie les plaques avec un papier, sans laisser les fibres sur les faces où
sera coulé le gel.
On pose le joint d'étanchéité sur la plaque à bords rond.
Puis, mise en place des espaceurs et de la deuxième plaque en verre. L'ensemble est ensuite consolidé à l'aide des pinces.
Préparation de 30 ml de gel de séparation:
7,50 mL d'acrylamide bis acrylamide
11,25 mL de tampon Tris/Hcl pH8,8
0,30 mL de SDS à 10%
10,95 mL d'eau
pour la polymérisation on ajoute
30 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
300 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%
La préparation est aussitôt coulée entre les 2 plaques à l'aide d'une pipette. Afin d'éviter la présence de bulle dans le gel, on incline le montage lors du remplissage. Le gel est ensuite
recouvert d'eau distillée afin d'obtenir une surface parfaitement horizontale.
Préparation de 10 ml de gel de concentration:
1,25 mL d'acrylamide bis acrylamide
1,25 mL de tampon Tris/Hcl pH6,8
0,10 mL de SDS à 10%
7,4 mL d'eau
pour la polymérisation on ajoute
40 microlitres de TEMED
et après agitation, on ajoute
100 microlitres de persulfate d'ammonium à 20%
Retirer l'eau distillée au dessus du gel de séparation puis remplir le montage comme précèdemment jusqu'au niveau supérieur des plaques de verre. Le peigne est alors mis en place pour
former des puits dans le gel de concentration.
Préparation d'un litre de tampon de migration:
12,5 mL de Tris 25mM
14,4 g de glycine
977,5 mL d'eau distillée
10 mL SDS 10%
Le peigne est retiré puis les plaques et les cuves de migration sont placées sur le support . Les cuves sont remplies avec le tampon de migration en commençant par la partie supérieure puis
inférieure. Dépot de 50 microlitres d'échantillon protéique dénaturé dans chaque puit à l'aide d'une seringue et selon la technique sous-marine.
Les électrodes de la cuve sont reliées au générateur. La migration se fait à 30 mA jusqu'à ce que le bleu de bromophénol atteigne le bord inférieur des plaques.
Révélation:
Le gel est retiré des plaques puis placé sur un agitateur et coloré pendant 30 minutes dans une solution de coloration composée de bleu de coomassie à 2,5%,d'isopropanol à 20%, d'acide acétique à
20% et d'eau à 57,5% puis décoloré pendant 3 fois 30 minutes avec une solution décolorante composée de 45% d'isopropanol, de 10% d'acide acétique et de 45% d'eau.
Par Magniez frédérick
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Mardi 8 avril 2008
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/2008 11:27
Histoire:
La technique d'ELISA a été conceptualisée et développée par 2 scientifiques suédois, Peter Perlmann (investigateur principal) et Eva
Engvall à l'Université de Stockholm en 1971.
A la fin des années 60, Stratis Avrameas et GB Pierce mettent au point la technique d'immunoenzymologie, technique d'analyse par
réaction entre antigènes et anticorps et utilisant comme marqueur des enzymes.
Principe:
La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de
visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.
Avantages de la technique:
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L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.
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Possibilité de quantifier grâce à la réalisation d'une gamme en parallèle.
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L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible.
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technique accessible à tous les biologistes.
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La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage spécialisé.
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La validité des trousses est d'environ 1 an.
Inconvénients de la technique:
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La limite de détection est moins bonne que la technique RIA.
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La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température, du pH et de l'éclairement.
Le test ELISA indirect:
Ce test permet de détecter ou doser des anticorps.
il se réalise en 4 étapes:
La première étape appelée "coating" de l'antigène:
Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les plaques sont
incubées à 4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage.
La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont ensuite lavés pour
éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de lavage.
La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de détection:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent
spécifiquement sur les anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont
couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grace à l'apparition d'une coloration.
La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:
On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une
coloration dans le substrat indique la présence de l'anticorps à doser. L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps
recherché.
Exemple d'application:
Identification dans le sérum du patient, les anticorps anti-protéines de l'enveloppe et du corps du virus de l'immunodéficience humaine.
Le DAS ELISA direct ou Double Antibody Sandwich ELISA direct:
Dans ce cas de figure,
l'antigène se trouve entre 2 anticorps spécifiques. L'utilisation de la DAS ELISA nécessite de posséder 2 anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents sur l'antigène.
La première étape consiste à fixer sur le support, l'anticorps de capture. On incube la solution à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.
Lors de la deuxième étape, on dépose l'échantillon possédant l'antigène à identifier qu'on laisse incuber à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.
Dans une troisième étape, on fixe l'anticorps de détection marqué avec une enzyme sur l'antigène recherché. Pour cela, on dépose la solution d'anticorps dans les puits puis on
incube l'ensemble à 37°C pendant 2 heures.
La dernière étape, on dépose une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme et on laisse incuber pendant 30 à 120 minutes. Le
produit de réaction obtenu est soluble et coloré. L'intensité de cette coloration peut être mesurée à l'aide d'un photomètre.
NB: la différence entre le DAS ELISA direct et le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine réside au niveau de l'anticorps de détection. Pour le DAS ELISA
indirect par le système biotine-streptavidine, l'anticorps de détection porte une molécule de biotine qui interragie avec la
streptavidine couplé à une enzyme.
La sensibilité du test DAS-ELISA direct se situe entre 1 et 10 ng/ml. Cette sensibilité peut être augmentée par l'utilisation du système indirect du fait de la
forte affinité entre la streptavidine et la biotine.
Par Magniez frédérick
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Mardi 11 mars 2008
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/2008 11:15
Définition:
Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont identiques car produits par un clone de cellules spécialisées du système
immunitaire (les plamocytes). Les anticorps monoclonaux sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic et dans des buts
thérapeutiques.
La production de ces anticorps in-vitro est très difficile à cause de la faible durée de vie des plasmocytes.
In-vivo, la production de ces anticorps peut être obtenue en injectant chez l'animal un antigène donné puis extraction de
ceux-ci dans le sang. Cette méthode est très couteuse et très peu d'anticorps sont obtenus.
L'élaboration de la technique des hybridomes par César Milstein et Georges köhler en 1975 a permis
d'obtenir une grande quantité d'anticorps à faible coût et ainsi permettre de les utiliser dans de nombreuses applications.
Cette technique consiste à injecter l'antigène d'intérêt chez une souris puis de prélèver, au bout de quelques semaines, les cellules de
la rate. Parmis ces cellules se trouvent des plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi. On fusionne ces plasmocytes avec des cellules de
tumeur appelées cellules myélomateuses (cellules immortelles) grâce à l'addition de polyéthylène glycol (PEG) qui induit la fusion membranaire et permet ainsi d'obtenir des
hybridomes qui ont la capacité de se multiplier plus rapidement que les cellules normales du corps productrices d'anticorps et de développer indéfiniment des anticorps spécifiques.
Les cellules sont ensuite réparties dans des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits. Afin d'éliminer les plasmocytes et les cellules myélomateuses non
fusionnées, on utilisera un milieu de culture sélectif (milieu de culture HAT). Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et les cellules myélomateuses utilisées ayant un gène non
fonctionnel pour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides-hypoxanthine - guanine - phosphoribosyl - transférase (HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT
(hypoxanthine aminoptérine thymidine).
Seules les cellules hybrides se multiplient. Au bout d'une dizaine de jours, on
recherche dans chaque puits la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène utilisé pour immuniser la souris. On repique les cellules productrices. On isole ainsi quelques clones
cellulaires producteurs qui pourront être conservées dans l'azote liquide.
Exemples d'application:
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Test d'ovulation: les anticorps monoclonaux anti-hormone lutéinisante qui révèlent l'augmentation du taux d'hormone LH (signe
précurseur de l'ovulation).
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Test de grossesse: le principe repose sur la détection de l'hormone hGC (human Chorionic Gonadotropin) dans les urines par le biais
d'une réaction colorée spécifique grâce à l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-hGC.
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Fabrication des anticorps monoclonaux contre des antigènes portés par des cellules tumorales
afin de les détruire. L'intérêt de l'utilisation des anticorps monoclonaux pour un traitement anti-cancereux réside dans la spécificité de ceux-ci à détruire des cellules cibles. On peut soit utiliser des anticorps seuls (anticorps nus) qui en s'attachant
à la cellule entraînent sa mort ou associés à une autre molécule comme une toxine ou un produit radioactif. L'anticorps sert dans ce cas là, à amener vers la cellule tumorale l'élèment qui
va la détruire.
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Test ELISA: utilisation des anticorps monoclonaux comme anticorps traceurs dans le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay). Ce type de test est utilisé notamment dans le dépistage de la séropositivité au virus VIH, c'est à dire pour mettre en évidence la présence d'anticorps anti-VIH dans le
sérum.
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Inconvénient :
Comme la plupart des anticorps monoclonaux sont produits dans des cellules de rongeurs, on
peut observer une réaction immunitaire lors de leur injection chez un patient. Cette imunité inactive progressivement l'action bénéfique de l'anticorps monoclonal. Pour remédier à ce
problème, on produit des anticorps "chimériques" ou "humanisés".
Les anticorps "chimériques" sont obtenus par greffage des parties constantes d'immunoglobuline humaine sur les parties
variables d'un anticorps de souris.
les anticorps “humanisés” sont produits par fermentation microbienne ou par
des souris transgéniques contenant seulement une partie des gènes humains à l'origine des Anticorps. Ils sont potentiellement mieux tolérés dans l'organisme humain.
Par Magniez frédérick
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Lundi 25 février 2008
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/2008 10:00
Présentation de la PCR:
cette technique fut imaginée par le scientifique américain Karry Bank Mullis et développée par le Dr H.A. Herlich avec la collaboration de la compagnie Cetus en 1985.
La PCR ou Polymérase Chain Reaction conduit à l'amplification in-vitro de plusieurs millions de fois une séquence spécifique d'acide nucléique qui peut être minoritaire voir très
rare (10-2pg). Elle exploite le processus de la réplication et fait appel, pour cela, sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d'un ADN servant de
matrice. Pour initier le processus, des amorces (ou primer) s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN polymérase de répliquer les 2
monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de nouveaux ADN doubles brins.
La PCR s'effectue sur 3 étapes:
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La dénaturation thermique de l'ADN: à 95°C, les liaisons d'hydrogènes sont rompues et les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme
simple brin dans le milieu.
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Hybridation des amorces: le milieu réactionnel contient 2 amorces, chacune complémentaire d'un des 2 brins. La température permettant la fixation
des amorces sur les monobrins d'ADN est comprise entre 50°C et 65°C. Les amorces en larges excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires.
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Extention des amorces: intervention de la taq polymérase (ADN polymérase) qui allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléiques
complémentaires de la séquence de la matrice auquel elle est hybridée. Cette étape s'effectue à une température de 72°C.
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Au deuxième cycle: la quantité d'ADN continue de doubler et les premiers brins dont la taille est limitée par les 2 amorces font leur
apparition.
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Au troisième cycle: Les premiers amplicons apparaissent (ADN double brins borné par les amorces correspondant au fragment
d'ADN recherché).
En théorie, après n cycles, on augmente le nombre d'ADN interressant de 2n.
En pratique, le nombre de brins est limité à cause de la baisse de certains réactifs, l'augmentation de la viscosité du milieu et la baisse de l'activité de l'ADN polymérase thermostable.
A l'issue de la PCR, on obtient des fragments de même taille correspondant à la distance en base qui sépare les amorces.
La technique PCR se réalise par le biais d'un appareil programmable appelé un thermocycleur dans lequel sont placés les microtubes contenant le
mélange réactionnel. Cet appareil permet d'exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l'expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide, elle ne dure
que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).
Composition du mélange réactionnel dans les microtubes:
Le mélange s'effectuera toujours sur la glace et les différents élèments qui le compose seront placés dans l'ordre suivant dans les
microtubes:
H20, le tampon, MgCl2, les nucléotides, les amorces, l'enzyme ( taq polymérase) et enfin l'ADN à amplifier.
NB: on réalise toujours un témoin dans lequel l'ADN est remplacé par de l'eau (témoin négatif) afin de déceler une éventuelle contamination (la
contamination par de l'ADN précédemment amplifié représente le principal risque). Un témoin positif permettra de valider la bonne conservation des réactifs, de l'enzyme responsable de la
polymération et des performances du thermocycleur. un témoin interne présent dans le milieu réactionnel renseignera sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de
l'amplification.
Révélation des produits d'amplification:
Lorsque la quantité de produits d'amplification est suffisante, ceux-ci sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire
migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt (Bromure d'éthydium: produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques faisant apparaitre à la molécule
d'ADN une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 30 nm)). La vitesse de migration étant dépendant de la masse de la molécule, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la
présence et la taille des amplicons peuvent être facilement vérifiable sur le gel.
Intérêts de la technique PCR:
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La PCR peut être un outil très avantageux dans la détection de génes mutés responsables de cancers et de maladies génétiques.
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Elle peut également être très utile pour le suivi des thérapies anticancéreuses et ainsi permettre au médecin de poursuivre ou pas le traitement.
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Comme certains cancers sont induits par translocation chromosomique, la PCR identifie la présence ou pas de réarengements
chromosomiques avec une sensibilité plus importante par rapport à d'autres techniques (elle peut ainsi détecter une cellule cancéreuse pour un million
de cellules normales).
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La PCR peut servir dans la détection d'infection virale ou bactérienne. Elle est utilisée dans l'identification du virus du SIDA.
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La PCR peut intervenir dans l'étude concernant l'évolution des espèces. La divergence des espèces à partir d'un ancêtre commun est reflétée par le
degré de divergence entre les séquences nucléotidiques des génes. La mesure de cette divergence nucléotidique peut être utilisée pour déterminer le lien de parenté entre différentes
espèces.
Par Magniez frédérick
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Lundi 18 février 2008
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/2008 00:00
La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mis au point le protocole en
1884.
Les bactéries présentent toutes une paroi constituée d'une substance, la muréine qui est un peptidoglycanne. Celle-ci est recouverte par une membrane externe chez les bactéries Gram-, tandis que
les bactéries à Gram+ en sont dépourvues. Cette paroi de part son organisation permet de les classer soit dans les Gram+ ou les Gram-. Cette information est importante car elle est utilisée dans
la taxonomie. Elle permet ainsi, avec la reconnaissance de la morphologique et le mode de groupement des bactéries de renseigner sur l'ordre dont fait partie les bactéries étudiées.
Cette coloration de Gram se réalise en 7 étapes:
1 On réalise un frottis sur une lame de microscope à partir d'une suspension bactérienne: on agite la suspension afin de
l'homogénéiser et d'éviter d'avoir un culot au fond du tube. Avec l'aide d'une anse que l'on aura préalablement stérilisé (en la passant sous le bec benzène), on prélève un peu de la
solution bactérienne en plongeant le fil de platine de la anse dans le tube à essai.
2 On dépose ensuite ce prélèvement au milieu de
la lame en faisant des rotations jusqu'à séchage.
3 On procède à la fixation du
frottis soit avec de l'éthanol à 90° (5 minutes) puis on enflamme la lame ou on passe directement 3 fois la lame dans la flamme du bec Bunsen.
4 La coloration au violet de
Gentiane (colorant basique): la lame est plongée pendant 2 à 3 minutes (en fonction de la concentration) dans la coloration au violet de gentiane. Toutes les bactéries sont
colorées en violet puis rincer à l'eau déminéralisée.
5 Mordançage au lugol (solution iodo-iodurée) :
étaler le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. Cette étape permet de stabiliser la coloration violette.
6 Décoloration à l'alcool:
verser goutte à goutte l'alcool sur la lame inclinée obliquement. Surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet
d'eau déminéralisée. L'alcool pénettre dans la bactérie. La coloration au violet de Gentiane disparait. Les bactéries décolorées sont des bactéries Gram-. Si l'alcool ne traverse pas la paroi, on
est en présence de bactéries Gram+.
7 Contre coloration avec de la Fuchsine ou de la
Safranine: laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15
minutes. Les bactéries Gram- sont colorées en rose.
Exemples:
Les bactéries à Gram+:
Les Staphylocoques apparaissent en "grappe de raisin" violette.
les Streptocoques sous la forme d'une chainette violette.
Les bactéries à Gram-:
Echérichia coli (enterobactérie) apparait sous la forme de bacille rose.
Pourquoi les bactéries à Gram- ne restent-elles pas colorées en violet après la décoloration à l'alcool comme
les bactéries à gram+?
La paroi des bactéries Gram+ est composée d'une 40ène de couche de peptidoglycanne ne permettant pas à l'alcool de traverser cette paroi
épaisse tandis que la paroi des bactéries à Gram- n'est formée que d'une seule couche de peptidoglycanne.
Par Magniez frédérick
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Publié dans : biotechnologies
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