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biotechnologie

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que sait-on sur le coronavirus (COVID-19)

22 Mars 2020 , Rédigé par Mr Magniez

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Microscope optique

14 Janvier 2020 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

INTRODUCTION:

Nous ne pouvons pas distinguer deux objets (ou points) qui se situent plus près que 0,1 mm.

La taille moyenne d’une cellule est 20 μm, inaccessible à l’œil nu.

les premiers microscopes furent donc optiques ou photoniques, avant de mettre à profit d’autres rayonnements ou effets physiques.

Objectif du microscope:

  • donner une image grossie d’un petit objet (grossissement)
  • sépare les détails de celui-ci sur l’image (résolution)
  • rend les détails visibles à l’œil ou avec une caméra

HISTOIRE:

1632: Invention du microscope optique:

Anton Van Leeuwenhoek (1632-1723), naturaliste Hollandais et marchand d’étoffes, connu comme étant le père du microscope optique.-Il développa la conception du microscope.

l fabriqua ses propres microscopes, constitués chacun d’une petite plaque de métal portant une lentille simple extrêmement convexe qui permettait d’observer l’objet monté sur une pointe très fine.

En 1680 Anton Van Leeuwenhoecka fait les premières observations en microscopie optique avec un grossissement de 300 fois environ.-Il publie ses lettres et ses dessins de bactéries, protozoaires, spermatozoïdes, globules rouges et autres dans la revue Philosophical Transactions of Royal Society.

PRESENTATION TECHNIQUE:

Le microscope  optique utilise la lumière. Il est doté de deux lentilles.

  • l'objectif, pour agrandir l'objet que l'on souhaite observer (il existe plusieurs grossissements) ;
  • l'oculaire pour que les rayons arrivent à l’œil de manière parallèle, ce qui permet à l’œil de se reposer.

Des instruments supplémentaires permettent de régler la quantité de lumière (le diaphragme) ou la mise au point (molettes liées à un système de crémaillère) pour affiner l'observation de l'échantillon placé sur la platine porte-échantillon.

La résolution des microscopes optiques ne peut être supérieure à 0,2 micromètre, cette résolution étant limitée par la diffraction de la lumière. Des techniques permettent de s'approcher de cette limite : l'utilisation d'un objectif à immersion (dans l'huile), ou en diminuant la longueur d'onde de la lumière (toutefois limitée au visible).

Sur quel principe optique, le microscope fonctionne-t-il? :

OBJECTIF:

l'objectif du microscope  est formé d’une lentille convergente de courte focale (quelques mm). Un objet placé à proximité de son foyer donne une image intermédiaire agrandie et renversée. Le grandissement de l’objectif est noté G1. Un dispositif de rotation permet de changer l’objectif.

L’OCULAIRE.

C’est une lentille convergente de plus grande focale (quelques cm). Il sert de loupe en grossissant l’image intermédiaire donnée par l’objectif.Le grossissement de l’objectif est noté G2.

Le grossissement commercial d’un oculaire est généralement compris entre 5 et 25. C’est l’indication mentionnée sur l’oculaire.

Comment calcule-t-on le grossissement du microscope?

grossissement du microscope = grossissement objectif x grossissement oculaire

Agrandir ne suffit pas!!!

Le microscope doit être capable de séparer des détails très voisins c'est le pouvoir de résolution

Pouvoir de résolution=0,61λ/n sin α

  • n= caractérise un milieu translucide
  • α= demi angle du cône de vision de l’objet par l’objectif du microscope.
  • λ = longueur d’onde

Or n=c/v donc dépend de la vitesse de la lumière dans le vide et de la vitesse de la lumière dans le milieu.


Mise au point::

La mise au point consiste en un réglage permettant d’observer l’image de l’objet au travers du microscope sans que l’œil ait à accommoder (c’est-à-dire que l’image au travers du microscope se forme à l’infini).

C’est l’ensemble du tube que l’on déplace par rapport à l’objet :Les lentilles objectifs et oculaires sont fixes l’une par rapport à l’autre La distance qui les sépare est donc constante.

Le condensateur:

Situé entre la préparation et le dispositif d’éclairage, le condenseur est un système optique qui contrôle le cône lumineux envoyé sur la préparation; la qualité de l’image dépend de son réglage méticuleux.

La lumière issue du condenseur converge vers la préparation; lors de son passage à travers la préparation la lumière devient divergente et forme un cône inversé (par rapport au cône convergent envoyé par le condenseur) qui est capté par la lentille frontale de l’objectif.

Comment utilise-t’on le microscope optique ? :

Installation du microscope:

Placez le microscope la poignée (ou statif) devant vous.

- Branchez la prise du microscope et allumez la lumière.

- Utilisez toujours en premier l’objectif le plus faible.

- Mettez un maximum d’éclairage en ouvrant complètement le diaphragme.

ATTENTION A NE PAS METTRE LES DOIGTS SUR L’OCULAIRE,LES OBJECTIFS OU EN PLEIN MILIEU DE LA PREPARATION QUE VOUS ALLEZ OBSERVER :ILS DOIVENT RESTER PROPRES POUR BIEN VOIR.

Disposition de la préparation et mise au point:

- Placez la préparation (ou lame) sur la platine du microscope,la lamelle dirigée vers le haut.Fixez la lame avec les pinces.

- Centrez la lame sur la région à observer.

- La mise au point se fait en deux étapes :

* regardez d’abord sur le côté du microscope et rapprochez au maximum l’objectif de la préparation avec la vis macrométrique (=la grosse vis).

ATTENTION POUR CETTE ETAPE, IL EST TRES IMPORTANT DE REGARDER SUR LE COTE ET PAS DANS L’OCULAIRE POUR EVITER QUE L’OBJECTIF CASSE LA PREPARATION EN VERRE (SURTOUT AU GROSSISSEMENT LE PLUS IMPORTANT).

* Puis regardez dans l’oculaire et éloignez lentement l’objectif de la préparation avec la vis macrométrique, jusqu’à voir quelque chose.

- Pour finir le réglage, vous pouvez améliorer l’image en tournant la vis micrométrique (=petite vis) et en réglant l’intensité de la lumière avec le diaphragme.

- Explorez la préparation pour trouver la zone la plus favorable.

- Passez à un objectif plus fort et ajustez la mise au point si nécessaire.

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Calculs des dilutions

9 Janvier 2020 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #info pratique

 

 

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Conversion d'unité

9 Janvier 2020 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #info pratique

 

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Décantation et Centrifugation

8 Janvier 2020 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

1. La décantation

Dans un mélange hétérogène, certains constituants peuvent être visible à l'œil nu. Considérons un mélange hétérogène solide-liquide comme une eau de rivière.

Dans ce type de mélange, les particules solides « nagent » en suspension dans le liquide. Si ce mélange reste au repos quelques heures, la gravité fait son travail et entraîne les particules lourdes au fond du récipient contenant le mélange. Les particules les plus légères restent en surface. Nous appelons cette technique de séparation  la décantation. C'est la première étape du nettoyage de l'eau dans les stations de captage placées au bord des rivières.

2. La centrifugation

La centrifugation constitue un procédé de décantation perfectionnée qui permet de gagner du temps, notamment dans les laboratoires d'analyse. En effet, il faut attendre quelques minutes, voire quelques heures pour que les particules les plus denses tombent au fond du récipient.

Dans les laboratoires, la centrifugeuse est un appareil qui reçoit des tubes à essais. Les tubes sont placés à l'intérieur. Une fois mise en route, la centrifugeuse tourne à des milliers de tours/minutes. Les particules solides présentes dans les mélanges sont alors plaquées au fond des tubes à essais. En haut du tube, un liquide clair apparaît.

PRINCIPES DE BASE

Une particule soumise à un champ gravitationnel tend à se déplacer dans ce champ jusqu'à ce qu'elle rencontre une résistance capable de l'arrêter complètement. Ce principe fondamental de physique est très utilisé en biochimie pour séparer des précipités, des cellules, des organites et même des macromolécules. En mettant une préparation biochimique dans le rotor d'une centrifugeuse et en faisant tourner celui-ci, on génère une accélération qui va pousser les particules qui la composent vers l'extérieur du rotor, c'est-à-dire le fond du tube à centrifuger. La vitesse avec laquelle se déplaceront ces particules est proportionnelle à

- la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise

- la masse de la particule

- la différence entre la densité de la particule et celle du solvant,

et inversement proportionnelle à

- la friction avec le milieu, en fonction de la taille et à la géométrie des particules.

Une particule donnée (e.g. une sous-unité d'un ribosome) a donc une vitesse spécifique de sédimentation lors d'une centrifugation parce qu'elle a une combinaison donnée de masse, de densité et de morphologie. On exprime souvent cette caractéristique en coefficient de sédimentation, généralement exprimée en unités Svedberg (S). Plus une particule est massive ou dense ou ne génère qu'une faible friction (due à sa forme), plus son S sera élevé. Cette unité de "taille" est particulièrement employée pour caractériser les particules ribosomiques. C'est pourquoi on parle encore de ribosomes 70 S chez les procaryotes et 90 S chez les eucaryotes.

On peut facilement générer une force centrifuge ( résistance au changement de direction imposé par une force centripète. C'est une résistance par inertie et non une force active) en faisant tourner à haute vitesse un rotor pouvant contenir des tubes à centrifuger. Une force gravitationnelle se forme alors perpendiculairement à l'axe de rotation du rotor.

Au cours de la centrifugation, les composés dans le fluide situés à une distance r de l'axe de rotation sont soumis à différentes forces:

  • La force de pesanteur descendante Fp
  • La  poussée d'Archimède ascendante Fa
  • Une force de friction  Fv
  • La  force centripète F'c
  • La force centrifuge Fc

Cette force centrifuge, exprimée en newtons, est donnée par la relation

Fc = mγc

avec γc = rω² en m/s²

dont :

  • La masse m du composé à séparer
  • La distance r du tube à l'axe de rotation de la centrifugeuse
  • La vitesse angulaire ω exprimée en radians par seconde ou en tour par minute.

la centrifugation  permet de séparer :

  • deux phases liquides ;

  • une phase solide en suspension dans une phase liquide ;

  • deux phases liquides contenant une troisième phase solide.

Il existe deux catégories principales de centrifugeuses :

  • les centrifugeuses à axe vertical, appelées communément clarificateurs ou séparateurs centrifuges (avec un bol à assiettes ou à chambres qui tourne sur un axe vertical) ;

     

  • les centrifugeuses à axe horizontal, appelées communément décanteurs centrifuges (avec un bol cylindroconique qui tourne sur un axe horizontal et une vis disposée à l’intérieur du bol permettant l’évacuation des sédiments).

 

L’ultracentrifugation est une méthode de centrifugation dont le but est de séparer  des particules très fines dispersées dans un liquide de densité pratiquement égale. Pour que cette séparation ait lieu la vitesse de rotation de la centrifugeuse doit dépasser les 15 000 tours par minute.

La centrifugeuse utilisée est appelée ultracentrifugeuse . Le rotor de cet appareil se déplace dans un vide, de sorte qu'aucune résistance de l'air ne se produise.

L’ultracentrifugation a été développée au milieu des années 1923 par Theodor Svedberg ( Il montra son utilité pour la séparation de protéines, ce qui lui valut la Médaille Franklin  en 1949. Il obtint le prix Nobel de chimie en 1926) . L’ultracentrifugation peut être utilisée pour des fins analytiques ou préparatives.

 

 

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Bactériophage et phagothérapie

16 Octobre 2017 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Définition:

Un bactériophage est un virus n'infectant que des bactéries.

En grec, phageton signifie nourriture/consommation.

Très utilisés dans la recherche en génétique moléculaire.

Les bactériophages sont présents dans l'ensemble de la biosphère. Ils sont présents en quantité plus importante dans les excréments, le sol et les eaux d'égout.

Histoire:

La découverte de l'activité des bactériophages se fait en 1915 par Frederick W. Twort (à Londres) qui remarque que des colonies de microcoques (virus de la vaccine (sorte de variole)) prennent parfois un aspect vitreux, en 24 h à 37 °C dû à une destruction des cellules bactériennes, et que cette caractéristique est transmissible à des colonies normales par simple contact.

En 1917, Félix d'Hérelle fait la même observation dans des selles de malades atteints de dysenterie bacillaire (maladie du côlon), isole les premiers phages, et développe les premières applications thérapeutiques. Le support de l'information génétique (génome) des bactériophages peut être un ADN ou un ARN. Si Twort a découvert les bactériophages, c'est d'Hérelle qui a découvert la phagothérapie.

 

Dans les années 1940-1960, les travaux effectués sur les bactériophages ont permis de faire de nombreuses avancées dans le domaine de la biologie moléculaire (avancées portées par Max Delbrück, dans le cadre du "groupe phage") et ont notamment permis de découvrir que les acides nucléiques constituaient le support de l'information génétique (expérience de Hershey-Chase en 1952).

morphologie et structure du bactériophage:

Le virion ne procède qu'un seul type d'acide nucléique : soit de l' ARN., soit de l' ADN.
1)    Le virion se produit à partir de son seul acide nucléique alors que les autres êtres se reproduisent à partir de la somme de leurs constituants.
2)    Le virion est incapable de croître et de subir des divisions binaires.
3)    Le virion n'a aucune information génétique concernant les enzymes du métabolisme intermédiaire (susceptibles de produire de l'énergie).
4)    La multiplication des virions implique l'utilisation des structures de la cellule hôte, et spécialement de ses ribosomes.


Classification des bactériophages:
Quatre critères essentiels sont retenus:
-    La nature des matériels génétiques (ADN ou ARN) ;
-    le type de symétrie suivant lequel le virus est construit (hélicoïdale, icosaèdrale, combiné) ;
-    le caractère nu ou enveloppé de la nucléo capside.
-    les données quantitatives concernant le virion a symétrie icosaèdrale, longueur et épaisseur des nucléo capside pour les virus a symétrie hélicoïdale.

Il y 4 types particulièrement étudiés. La plupart infectent E. coli.

Phage de la série T:

T2:

Ces phages sont à l'origine de beaucoup de manipulations de Biologie moléculaire, les T2 en particulier. (début du 20ème siècle:) A partir de l'étude du T2, HERSHEY et CHASE ont pu mettre en évidence que l'ADN était le support de l'information génétique. D'autre part, VOKIN et ASTRACHAN ont mis en évidence le rôle de l'ARNm et sa fonction biologique.

T7:

Les T7 sont utilisés pour des vecteurs de clonage comme promoteur fort.

Les T pairs comme les T2,4,6 appartiennent à la famille des Myoviridae. A la place de la Cytosine il y a de l'HydroxyMéthylCytosine dans leur génome. L'intérêt est que cela leur permet de résister aux enzymes de restriction lors de l'infection.

Les T impairs appartiennent à la famille des Podoviridae.

Tous les phages de la série T possèdent un ADN linéaire bicaténaire et possèdent une structure avec « tête et queue ».

Phage Tempéré:

Ils présentent deux cycles de multiplication, contrairement aux phages T.
-> un cycle lytique, comme les phage T,
-> un cycle lysogène: le phage s'intègre dans le génome bactérien au lieu de rester virion.
Le plus étudié est le phage "lambda" notamment pour les clonage.
Autres: phage P1, P22, P5 et phage Mu.

Petit phage à ADN:

Ce sont des phages de petite taille avec deux sortes de nucléocapside.
-> nucléocapside icosaédrique (comme X174, S13). L'étude de ces phages a été à l'origine de la découverte des gènes superposés.
-> nucléocapside filamenteuse (comme phage fd, phage M13). Ces phages sont très utilisés car ADN simple brin (donc facilement séquençable).

Phage à ARN:

Ils appartiennent à la famille des Leviridae comme le phage Qß, Ms2. Ils servent de modèles pour la traduction de l'ARN.

Les phages présentent différents types de génomes: ADN double-brins, ADN simple-brin, ARN; et différents types de structures de nucléocapside: filamenteuse, isocaïdrique ou comme les T2.

Structure des phages:

Depuis les surprenantes images de bactériophages "en forme de têtards" observées au microscope électronique par les premiers expérimentateurs (Ruska, en 1941, Lurai Delburck et Anderson en 1941), le développement considérable des recherches sur la structure des bactériophages a conduit à la description de nombreuses variétés morphologiques et à l'élaboration d'une véritable anatomie ultrastructurale de ces virus.
Actuellement en peut réunir les bactériophages en trois grands groupes morphologiques :
-    cubique.
-    Filamenteux.
-    Mixte.

Le phage lambda (λ ) est un virus à structure mixte. Le diamètre de la tête et de 100 mm. Les virions sont constitués par 12 protéines structurales localisées dans l'enveloppe (P9, P10 et P13), Peplomers (P3 et P6), nucléocapside (P8 et P5), complexe polymérase (P1, P2, P4 et 97) et une protéine non structurale P12. Les protéines constituent environ 70% du poids de la particule.

Deux Types de Cycles.

Infection lytique:

Ici le phage se multiplie au dépend de la bactérie et généralement la détruit. Ces sortes de phages sont dits « virulents ».

Infection lysogène:

Ici le génome du phage est injecté dans la bactérie, mais ne s'y réplique pas. Par contre il va s'intégrer dans le génome bactérien. La multiplication du phage se fait grâce à la réplication du chromosome bactérien. Le phage s'intègre à un seul endroit du génome bactérien.
Quand le phage est intégré, il y a un phénomène d'immunité qui préserve la bactérie d'une surinfection du même phage.
Un phage intégrer = prophage et seuls les phages tempérés ont la capacité d'avoir un cyle lysogène (ils possèdent aussi un cycle lytique).

Cycle lytique du phage T2.

Phase d'absorption:

Le phage se fixe sur la bactérie. C'est une phase fondamentale car il y a une reconnaissance spécifique entre le récepteur et le phage (sinon pas de fixation). Les conditions d'absorption dépendent, parfois des cofacteurs libérés par la bactérie qui va être parasitée.
Ex: T4 se fixe bien si la bactérie libère Tyr.
"lambda" se fixe bien si la bactérie libère Mg2+.
Le récepteur, au niveau de la bactérie, varie suivant le phage.
T2 = porine; "lambda" = porine lam B.
On retrouve ainsi des pilus sexuels (F) pour M13. Certains utilisent le LPS comme site de fixation.

Phase de fixation:

Pour le phage T2, la fixation est effectuée par les filament codaux et la plaque terminale. Elles devient rapidement irréversible. C'est ici que les enzymes de la plaque codale s'activent et hydrolysent les enveloppes bactériennes pour pouvoir injecter l'ADN virale.

Injection du Génome:

Elle est réalisée par contraction de la gaine externe qui favorise la pénétration du cylindre central.

Phase d'éclipse:

Après injection, le virion cesse d'exister, ne persiste que le génome dans la bactérie. Il n'y a plus de particule virale (environ 12 min). De nombreux évenements se déroulent alors: la synthèse de l'ADN bactérien est stoppé par le phage, une DNAse phagique va dégrader le génome bactérien (DNAse phagique pendant 2 à 3 min après l'injection , issue des gènes précoces). Il y a aussi production d'ARNm et production de protéines constituant la nucléocapside et, parallèlement l'ADN se mulitiplie. Cet ADN est formé sous forme de "concatemères" (= cercle roulant) c'est-à dire plusieurs séquences d'ADN collées à la suite. Ici accumulation des différents composants du phage: ADN phagique, nucléocapside => finde la phase d'éclipse.

Phase de maturation et libération:

Entre 12 à 15 min. L'ADN produit en concatemère est coupé en fragments de taille normale avec parfois des sources d'erreurs (101 à 112% taille totale du génome) donc fragments plus longs ou plus courts. Ce qui est à l'origine d'une importante mutation des phages. La nucléocapside se structure, il y a alors apparition de la particule virale = virions dans la bactérie.
Quand la bactérie accumule entre 100 à 200 virions, il y a activation d'une endolysine phagique qui entraîne l'éclatement de la bactérie et la libération des phages.

Cycle lysogène du phage "lambda" .

La strucutre est "tête et queue" mais ici le phage ne possède pas de filaments codaux. Ici, l'expression du phage est réprimée. Pour sortir de cette phase lysogène il faut que la bactérie hôte subisse "un stress" (rayons X, UV, agent mutagène,...) alors le phage devient productif -> cycle lytique.

Génome du phage "lambda" :

Il s'agit d'un phage qui infecte E. Coli K12. Il possède une génome double-brin à extrémités cohésives (donc circulaire).
Lorsque le génome du phage est infecté dans la bactérie il se circularise.
Taille » 49Kpb.

  • 1. --- Gènes impliqués dans la régulation de lysogénie.
    2. --- Gènes impliqués dans la recombinaison, c'est-à dire l'étape d'intégration (aH: séquence complémentaire qui permet l'intégration).
    3. --- Gènes impliqués dans la synthèse de m'ADN (lytique).
    4. --- Gènes impliqués dans le phénomène de lyse de la bactérie (lytique).
    Tout le reste sont des gènes qui codent pour la nucléocapside, des gènes structuraux.
Cycle lytique du phage "lambda" :

Il débute comme le phage T2.
Résistance à la bactérie = Lam B.
Quand le génome est injecté, il se circuralise et il débute sa transcription. Protéine Cro et N dès le début.
Cro = régule les cyles lysogène / lytique.
N = permet la synthèse d'ARNm de taille variable "aterminateur".
Puis CII, CIII et Q --> switch --> soit lysogène soit lytique.
Dans la phase lytique [Q] augmente ce qui entraîne l'augementation du régulateur Pro: on bloque alors les protéines qui activent la lysogénie (rétocontrôle +). Le phage produit alors des ARNm longs et donc fabrique sa tête et sa queue.
Comme le phage T2, l'ADN est répliqué sous forme de contatemère puis est réduis par une DNAse virale qui génère les extrémités cohésives (ex: EcoR1).

Cycle lysogène du phage "lambda" :

Pour qu'il soit induit il faut réprimer les gènes tardifs, qui codent pour le tête et la queue et activer les gènes de recombinaison. La protéine régulatrice est CI. Par un système de régulation génique, CI s'exprime et augmente ce qui inhibe les gènes tardifs. Il y a alors activation du cycle lysogène ou le génome viral s'intègre au génome bactérien. La sortie de cette phase lysogène (phase naturelle du phage) se fait par REC A (protéine bactérienne) qui est produit en cas de stress (RECA hydrolyse CI ce qui induit le cycle lytique).

Applications.

  • Diagnostic et Taxonomie:

Principe de la lysotypie: on s'en sert au niveau médical, au niveau industriel pour identifier les couches de levain. La recherche du phage est un indicateur de Contamination Fécale (eau, aliments,...).

Outils de la Biologie Moléculaire:
  • M12 possède un ADN monobrin donc utile pour le séquençage. ll est utilisé comme vecteur de clonage (phagemide) et comme un système de traduction in vitro (production d'ARNm).

 

  • la phagothérapie moyen pour lutter contre des infections bactériennes comme la maladie de Lyme?

La Borrelia responsable de cette maladie se soigne par antibiotiques, mais les traitements sont lourds et ne l’éliminent pas toujours. De plus, faisant partie des bactéries les plus rapides et les plus mobiles que l’on connaisse, on la sait capable de se loger dans tous les tissus du corps humain, se rendant comme invisible et, de ce fait, inatteignable par les antibiotiques. En effet, pendant toute la durée du traitement, elle peut se localiser sous forme de kyste spongieux, attirant les globules blancs qui finissent par s’agglutiner et ainsi la dissimuler. La bactérie s’en sort saine et sauve en laissant des lésions créées par l’amas de globules blancs.

En 1982, Hayes, Burgdorfer et Barbour ont enregistré et observé l'attaque d'un phage contre Borrelia burgdorferi in vivo et ont pris des photographies pour enregistrer l’événement. Les images capturées sont celles d'un bactériophage de type B3, décrit par les chercheurs comme ayant une "tête allongée de 40 à 50 nm et une queue de 50 à 70 nm de long. Il semble dépourvu de collets ou de structure en cerf-volant".

En 2001, Eggers et al ont publié leur découverte d'un phage de Borrelia burgdorferi (Bb) nommé phiBB-1 (également appelé φBB-1). Ce n'est pas le meilleur candidat pour une utilisation dans le traitement par les bactériophages, car il s'agit d'un phage lysogène tempéré.

Les phages lysogènes restent inactifs en tant que virus lorsqu'ils sont des prophages et ne se répliquent qu'avec le génome de l'hôte, à moins d'être mobilisés. En revanche, les phages virulents, ayant été répliqués et assemblés en virions complets, provoquent une lyse rapide et la mort de la cellule bactérienne, avec une libération de 10 à 100 virions par phage. Ces virions trouvent alors plus de proies et disparaissent lorsqu'elles ne peuvent plus trouver de bactéries. 

Malheureusement, à ce jour, ni les scientifiques, ni aucun centre de recherche n'ont travaillé sur le traitement des phages contre les souches de Borrelia.

 

L'un des obstacles majeur dans la recherche et la mise sur le marché de produits de phagothérapie est l'hyper spécificité des bactériophages à chaque souche de bactérie et donc peu adaptés au développement industriel, et par ailleurs difficilement brevetables.
 

Article en rapport avec ce sujet

https://www.francetvinfo.fr/sante/decouverte-scientifique/infection-bacterienne-une-jeune-fille-sauvee-grace-a-des-phages_3442843.html

 

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La protection des travailleurs contre les risques liés à l'exposition à des agents biologiques au travail

2 Décembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #réglementation

DIRECTIVE 2000/54/CE DU PARLEMENT EUROPÉEN ET DU CONSEIL

du 18 septembre 2000

 

concernant la protection des travailleurs contre les risques liés à l'exposition à des agents

biologiques au travail.

 

(septième directive particulière au sens de l'article 16, paragraphe 1, de la directive 89/391/CEE).

Pour avoir le lien au journal officiel, cliquez sur le lien si dessous:

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/FR/TXT/PDF/?uri=CELEX:32000L0054&qid=1417531278814&from=FR

 La protection des travailleurs contre les risques liés à l'exposition à des agents biologiques au travail
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Les hématimètres

18 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Histoire:

  • Louis-charles Malassez, scientifique français né à Nevers 1842-1909. Malassez est connu pour l'invention de l'hémocytomètre, un outil pour mesurer quantitativement le nombre de cellules sanguines.
  • Jean Nageotte, Né à Dijon 1866-1948. Il fut médecin de la Salpêtrière et professeur au collège de France. En 1902, il fait des essais de numération du liquide céphalo-rachidien et envisage la nécessité d'employer un hématimètre pouvant contenir 100 mm3 au moins de liquide.
  • George Hayem et A Nachet en 1875 élaborent un hématimètre à platine mobile transversalement pour déplacer réguliérement la cellule et faciliter la numération des globules blancs. http://gallica.bnf.fr/ark:/12148/bpt6k6274641v/f19.image​
hématimètre de Hayem  et Nachet

hématimètre de Hayem et Nachet

Définition:

 

Les numérations globulaires de différents liquides biologiques (sang, urine, liquide céphalo rachidien) sont possibles, en dehors de tout automate, grâce à l'utilisation de "cellules" de verres calibrées appelées hématimètres. Ces lames de verre épaisses creusées de rigoles, présentent un quadrillage particulier sur la plate-forme centrale légèrement abaissée. Recouverte d’une lamelle posée sur les platesformes latérales élevées, un volume très précis et connu permet de dénombrer les cellules des liquides biologiques.

  • Les prélévements de sang sont étudiés en utilisant les cellules de Malassez, Thoma ou Neubauer.
  • Les urines, on utilisera plutôt une cellule de Lemaur.
  • Les liquides céphalorachidiens, on comptabilisera en utilisant les cellules de Nageotte.

NB: Les prélévements riches en cellules doivent être comptés après dilution.

 

 

Protocole:

 

  • Passer la culture au vortex pour dissocier les amas cellulaires.
  • Repérer à l'oeil nu le quadrillage sur le centre de la lame.
  • Recouvrir avec lamelle en humectant les plates-formes latérales de l'hématimètre. Pour faire adhérer la lamelle appuyer légérement.
  • Remplir le quadrillage par capilarité, en déposant la culture à l'aide d'une pipette pasteur ou d'une micropipette. Appliquer l'extrémité de la pipette légèrement inclinée sur la plateforme centrale prés de la lamelle. Le liquide s'étend par capilarité. Le remplissage doit être rapide et réalisé en une seule fois, sans débordement dans les rigoles et sans bulles d'air.
  • Laisser les cellules sédimenter une à deux minutes avant observation.
  • Observer au microscope, objectif 10 ou 20 pour une vue d'ensemble. Vérifier la répartition homogène (si elle est hétérogène, recommencer la mise en cellule).
  • Selon l'hématimètre utilisé et selon les élèments comptés, on sera amené à compter un carré, une bande voire la cellule entière.

NB:Quel que soit l'hématimètre et la surface à compter, on compte tous les éléments situés à l'intérieur des lignes délimitant cette surface. Pour les éléments situés sur les lignes, on applique la régle de la limite des lignes, c'est à dire que les éléments qui sont présents sur le bord supérieur et sur le bord gauche sont comptabilisées mais pas ceux situés sur le bord inférieur et sur le bord droit afin d'éviter de les compter 2 fois.

 

 

Il est possible de différencier les cellules vivantes, des cellules mortes par l'utilisation de colorant.

Définition:

Un colorant est une substance qui met en évidence une structure cellulaire sans provoquer la mort immédiate de celle-ci.

Condition d'utilisation:

  • Le colorant doit être utilisé à concentration faible.
  • Il faut que ce colorant s'accumule dans un élèment cellulaire.

 

Il existe 2 types de colorants:

  • Les colorants vitaux ou d'inclusion. Ces colorants colorent les cellules vivantes. Exemple: le rouge neutre (colorant cationique) qui se concentre dans les vacuoles des cellules végétales et les lysosomes.
  • Les colorants supravitaux ou d'exclusion. Ces colorants colorent les cellules mortes. Ils ne se fixent que sur les cellules mortes car la membrane plasmique des cellules vivantes leur est imperméable. Une fois dans la cellule, le colorant entraîne un mécanisme d'exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme necessite de l'énergie sous forme d'ATP que seules les cellules vivantes possédent.  Exemples: Le bleu Trypan, l'érythrosine B, le bleu de méthylène de Funk (Il sera réduit sous forme incolore dans les cellules en activité), les colorants fluorescents ( l'iodure de propodium; le bromure d'éthydium).

Calcul des résultats:

 

Nous prendrons comme exemple l'utilisation de la cellule de Malassez.

la dimension d'une bande est de :

  • longueur 2,5 mm
  • largeur 2 mm
  • hauteur 0,20 mm

​Soit un volume du quadrillage total de 1 μL

Cette bande est constituée de 100 rectangles d'égales surfaces dont 25 sont dévisés en 20 petits carrés pour faciliter le comptage.

Un rectangle ou unité de comptage contient 0,01 mm3 c'est à dire 0,01μL

rappel: 1 mm3 = 1 μL = 1.10-3 mL = 1. 10-6 L

Formule à appliquer:

N= n/a.v x Fd

N: nombre de cellules par unité de volume

n: nombre de cellules comptées

Fd: facteur de dilution

a: nombre d'unités de comptage dénombrées

v: volume d'une unité de comptage

 

les différents types d'hématimètres différent par le volume de l'unité de comptage ou par le nombre total d'unité de comptage. On utilisera la même formule en adaptant ces différences dans le calcul.

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Les hématimètres

La cellule de Nageotte

Le quadrillage total est constitué de 40 bandes (chaque bande a un volume de 1,25 μL).

La dimension d'une bande est de :

  • longueur 10 mm
  • largeur 0,25 mm
  • hauteur 0,5 mm

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La cellule de Thoma

NB: La cellule de Thoma est déconseillée pour la numération des leucocytes du fait de sa faible profondeur.

Le quadrillage total:

  • Un grand carré de coté 1mm
  • Hauteur 0,1 mm​

Soit un volume du quadrillage total de 0,1 μ

La cellule de Thoma est constituée de 16 grands carrés contenant 16 petits carrés,  de 4 groupes de 3 lignes horizontale et de 4 groupes de 3 lignes verticales.

Les cotés de chaque petit carré mesurent 0,05 mm.

Le volume délimité par un petit carré est de 0,00025 μL soit pour 16 petits carrés un volume de 0,004 μL.

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Les hématimètres

La cellule de Neubauer

Les leucocytes sont comptés dans les quatre grands carrés bleus composés de 16 petits carrés (= 64).

Les érythrocytes et les thrombocytes sont comptés dans les 4 lignes rouges dans le quadrillage central

composé de 20 très petits carrés (= 80).

La hauteur entre la chambre et la lamelle est de 0,1mm.

 

Le volume est de :

- grand carré 1mm x 1mm x 0,1 mm = 0,1 mm= 0,1 μL

- très petit carré 0,05mm x 0,05mm x 0,1 mm = 0,00025 mm= 0,00025 μL

Les hématimètres
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Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

6 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #biotechnologies

Principe générale :

Les prises d’essais de l’échantillon d’eau ou de ses dilutions sont incorporées dans un milieu de culture liquide conçu pour permettre la croissance d’un micro-organisme ou de groupe de microorganismes. La croissance se traduit par l’apparition d’un trouble du milieu et, éventuellement, une modification visible (virage d’un indicateur de pH coloré).

 

Principe de la méthode du nombre le plus probable:

cette méthode est une estimation statistique du nombre de micro-organismes supposés distribués dans l’eau de manière parfaitement aléatoire.

L’estimation de la densité  bactérienne est obtenue par application du principe de vraisemblance, à partir de réponses positives observées pour une ou plusieurs dilutions successives de la suspension bactérienne originelle dans des milieux de cultures liquides. Il s’agit d’une méthode quantique et non pas énumératif.

 

Protocole expérimental d'une dilution successive de facteur 10:

Matériel:

  •  5 tubes contenant 9 mL de diluant (eau distillée en général sauf indication contraire: eau physiologique, eau peptonée, tryptone-sel, ...).
  • 5 pipettes stériles en plastique de 1mL
  • 1 vortex (facultatif)

Réalisation de la dilution  de facteur 10:

  • Homogéneiser la suspension microbienne à prélever (agitation par mouvements circulaires pendant 10 secondes environ ou à l'aide d'un vortex).
  • Ouvrir et flamber l'ouverture du tube.
  • Prélever 1mL de suspension à l'aide de la pipette plastique stérile (ne pas introduire la pipette dans la suspension de plus de 1cm).
  • Flamber et refermer le tube.
  • Ouvrir le tube de 9 mL de diluant, flamber l'ouverture y introduire le volume prélevé (éviter tout contact entre la pipette contenant l'inoculum et le diluant stérile).
  • Flamber et refermer le tube.
  • Jeter la pipette souiller dans le bac à eau de javel.

La dilution suivante s'effectue comme la dilution décrite ci-dessus mais en partant du tube de la dilution précédente.

Exemple: 

La dilution 10-5 sera effectué en prenant 1mL de la dilution 10-4 préalablement  homogenéïsée qui sera introduit dans un tube contenant 9 mL de diluant.

L'utilisation de cette méthode avec un tube par dilution entraîne une forte incertitude que des methodes statistiques tentent de pallier par des essais multiples (2 ou 3 tubes par dilution).

Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

 

Observation des résultats:

 

La seule manière de savoir si un micro-organisme est présent ou non dans l'inoculum par les techniques en milieu liquide sera de le mettre en évidence par un de ses caractères:  trouble et production de en gaz en BLBVB (bouillon lactose bilie au vert brillant).

 

Si l'un de ses caractères apparait, le résultat sera positif.

L'absence de l'un de ses caractères, le résultat sera négatif.

 

exemple de resultat:

Volume de l'inoculum: 1mL  Produit pur 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultat + + + + - -

Il y a au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-3  et moins d'un micro-organisme dans 1mL  de la dilution 10-4 et donc on peut en déduire qu'il y a au moins 103 micro-organismes mais moins de 104 micro-organismes dans 1mL de produit pur.

Résultat avec des essais multiples (3 tubes par dilution):

 

Dilution produit pur 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultats +++ +++ +++ ++- +-- ---
Chiffre égal à la somme des tubes positifs 3 3 3 2 1 0

Interprétation statistique: méthode du NPP (table de Mac Grady):

 

Dans la ligne "chiffre égal à la somme des tubes positifs", choisir le nombre à 3 chiffres le plus grand possible et inférieur à 330 (meilleur répartition dans les dilutions).

Se reporter au table de Mac Grady pour 3 tubes de dilution afin de trouver le NPP correspondant au nombre 321: le NPP est 15.

Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10--2  mL. D’après les limites de confiance données par certaines tables, cette valeur numérique de 15 est en fait considérée comme comprise entre 3 et 38 avec une probabilité de 95 %, entre 2 et 52 avec une probabilité de 99 %. 

Méthode de dénombrement des micro-organismes en milieu liquide (Méthode dite du nombre le plus probable).

En déduire la concentration en micro-organismes par mL de produit pur N.

NPP= nombre le plus probable obtenu par lecture de la table de Mac Grady

V inoculum= 1 mL

Fd= facteur de la dilution correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique 10-2

 

N= NPP /V inoculum * Fd

15/0,01 =15 102  micro-organismes par mL

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Les postes de sécurité microbiologique (PSM)

4 Novembre 2014 , Rédigé par Mr Magniez Publié dans #hygiène et sécurité

Les PSM se définissent comme des postes destinés à assurer la protection de l'opérateur et de l'environnement contre les dangers liés aux aérosols dans la manipulation de substances biologiquement actives infectées ou dangereuses, à l'exception des substances radioactives, toxiques ou corrosives, l'air rejeté dans l'atmosphère étant filtré.

Leur typologie peut être abordée de 2 façons en établissant:

  • soit une classification selon les objectifs de protection (qui ou que veut-on protéger?).
  • Soit une distinction entre les domaines d'application basée sur l'importance du risque d'infection.

Classification selon les objectifs de protection:

Les PSM du type I:

Ils assurent simultanément la protection du manipulateur par la création d'un flux d'air entrant dans l'enceinte et de l'atmosphère par l'évacuation du flux d'air hors de l'enceinte à travers un filtre à très haute efficacité. Par contre ils n'assurent pas la protection du produit car celui-ci est baigné par de l'air en provenance directe du laboratoire.

Les postes de sécurité microbiologique (PSM)

Les PSM du type II:

Ils assurent la protection du manipulateur par une aspiration créée au bord avant du plan de travail constituant une barrière immatérielle entre le manipulateur et la manipulation. Ils assurent également la protection de l'atmosphère par l'évacuation du flux d'air hors de l'enceinte à travers un filtre à très haute efficacité. En outre, ils assurent la protection du produit manipulé contre la contamination à l'aide d'un flux d'air unidirectionnel vertical descendant à très haute efficacité, la contamination pouvant provenir aussi bien de l'atmosphère du laboratoire que d'autres produits manipulés simultanément.

Les postes de sécurité microbiologique (PSM)Les postes de sécurité microbiologique (PSM)

Les PSM du type III:

Ils assurent la protection du manipulateur par la création d'un volume entièrement fermé et du produit par l'alimentation de l'enceinte en air à travers un filtre à très haute efficacité. Ils assurent également la protection de l'atmosphère par l'évacuation du flux d'air hors de l'enceinte à travers, en général, deux filtres à très haute efficacité placés en série. Ils n'assurent pas de protection particulière du produit contre la contamination croisée en raison de l'absence découlement d'air unidirectionnel dans l'enceinte.

Les postes de sécurité microbiologique (PSM)

Classification selon l'importance du risque d'infection:

 

Du fait de l'absence ou la présence d'une paroi matérielle entre la manipulation et le manipulateur, les PSM présentent des degrés de protection différents selon les types.

L'utilisation des PSM se font dans le cadre de la manipulation des micro-organismes. Ceux-ci sont classés en 4 groupes en fonction de l'importance des dangers infectieux qu'ils font courir à l'individu et à la collectivité.

 

Classification des micro-organismes selon leur dangerosité

 

Groupe

 

Niveau de dangerosité pour le travailleur

Niveau de dangerosité pour la collectivité

Présence ou absence de prophylaxie ou de traitement

1 Ils ne provoquent pas de maladie (aucun danger pour le travailleur) aucun danger pour la collectivité -
2 Ils peuvent provoquer des maladies (danger pour le travailleur) propagation peu probable prophylaxie ou traitement efficaces
3 Ils peuvent provoquer des maladies graves (danger sérieux pour le travailleur) propagation possible prophylaxie ou traitement efficaces
4 Ils peuvent provoquer des maladies graves (danger sérieux pour le travailleur) propagation élevée absence de prophylaxie ou traitement efficaces

Les laboratoires confinés L2 et L3 doivent être équipés d'au moins un PSM du type II.

Les PSM du type II doivent être conformes à la norme EN 12469. De sucroît en France, ils peuvent répondre aux éxigences du règlement de la marque NF, certifiée par me LNE. En conséquence, sur ces équipements, le marque "CE" est obligatoire et la certification NF est recommandée.

Les PSM ne sont pas conçus pour assurer une protection contre les risques chimiques ou radioactifs.

Quelques conseils dans l'utilisation des PSM:

 Avant les manipulations

• Mettre en route le PSM et attendre 15 minutes.

• Anticiper l’ordre des manipulations afin d’éviter les entrées/sorties de matériels du volume de travail, c’est-à-dire regrouper le matériel nécessaire à l’ensemble des manipulations prés du PSM.

• Retirer ses bijoux (bagues, bracelets, montres…).

• Nettoyer le plan de travail et les parois avec un détergent non agressif (eau de javel

interdite) puis désinfecter (éthanol 70 %, spray désinfectant...).

• Se laver les mains soigneusement.

• Nettoyer les matériels nécessaires aux manipulations avec l’éthanol à 70 % et les

disposer dans le volume de travail du PSM. Veiller cependant à ne pas trop encombrer l’enceinte pour éviter de perturber le flux laminaire.

 

 Pendant les manipulations

 

• N’utiliser dans l’enceinte que du matériel à usage unique stérile (pipettes gradées stériles, anses stériles…).

• Effectuer des gestes calmes à l’intérieur du volume de travail et surtout lors du passage

dans la veine de garde (introduction et retrait des mains du volume de travail).

• Maintenir dégagées les grilles de reprise d’air.

• Manipuler au centre de la surface de travail et surtout pas au-dessus des grilles de reprise d’air (au moins à 10 cm de la grille avant), en évitant les mouvements rapides et gestes brusques.

• Jeter le matériel souillé dans un conteneur à déchets biologiques.

• Ne pas placer une flamme nue (bec Bunsen) sous le PSM pour ne pas perturber le flux laminaire et ne pas détériorer les filtres par la chaleur.

• Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile.

• Ne pas projeter de liquide ou de solide sur la face interne du filtre.

 

 

 Après les manipulations

• Ranger le plan de travail et s’assurer de n’y laisser que les portoirs à tubes.

• Nettoyer le plan de travail et les parois avec un détergent non agressif (eau de javel

interdite) puis désinfecter (éthanol 70 %, spray désinfectant...).

• Laisser fonctionner le PSM en position " travail" encore 15 à 20 minutes.

• Se laver les mains soigneusement.

 

 Maintenance périodique

 

Nettoyer à fond le PSM réguliérement, y compris le bac de rétention situé sous le plan de travail. Ce nettoyage doit se faire avec le PSM éteint pour éviter que les lingettes soient aspirées et aillent colmater le filtre.

 

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